固定化微生物技术在重金属污染土壤修复中的研究进展

金建勇，孙玉焕

（青岛科技大学 环境与安全工程学院,山东青岛 266042）

工业化和科技的快速发展导致了土壤被大量重金属和类金属污染，被污染土壤中的重金属主要包括汞、镉、铅、铬和类金属砷等生物毒性显著的元素，以及有一定毒性的锌、铜、镍等元素。重金属在土壤中难以降解，是一种一旦出现，便长期存在的污染物，而且易进入食物链，已成为人类和环境的一种主要威胁［1］。综合国内外研究进展，土壤重金属污染的修复方法主要包括物理修复、化学修复和生物修复。物理修复是指使用电能或热能将污染物质固定或转化为无毒或毒害性小的物质，物理修复虽然周期短，但是应用范围小且能耗大；化学修复是使用还原剂或其它药剂将毒性高、迁移性强、稳定性差的重金属或类金属还原为毒性很小、稳定性较强的价态或者化合物，修复周期短且具有成本效益，但是引入其它药剂后容易造成二次污染且不稳定，如有研究表明Cr（III）在经过一段时间的化学还原后，可能再被氧化为Cr（VI）［2-3］。固定化微生物技术是生物修复技术中的一种，相对于物理和化学的方法，固定化微生物技术弥补了许多传统修复方法存在的问题，固定化微生物技术以微生物为对象，着重于资源的再利用，具有成本低廉，高效稳定，后期维护方便，极大降低了二次污染等优点，从而能成为一种重要的土壤重金属污染修复方法［4］。

在被重金属污染的区域，往往存在对此重金属抗性极大的微生物，而且许多天然或转基因微生物具有降解、转化或螯合各种有毒化学物质的能力。固定化微生物技术是利用物理或化学手段将这种具有特定功能的微生物固定于载体材料内部或表面，加以有效利用来处理污染物的技术。1959年Hattori［5］将大肠杆菌固定在树脂载体上，首次实现了大肠杆菌的固定化，自此揭开了固定化微生物技术的篇章。本综述阐述了固定化微生物技术在土壤重金属污染修复中的研究进展。

1 固定化微生物技术修复机理

金属或类金属的不同氧化状态决定了它们的迁移率和毒性，所以氧化还原电位的变化是影响修复效果的一个重要因素［6］。微生物不能降解和破坏重金属，但微生物是一种金属固定剂，能够通过生物吸附、生物积累和生物矿化作用来改变重金属的理化性质或价态来影响重金属的迁移转化或氧化还原沉淀反应，从而降低其毒性［7］。

活微生物对金属的生物吸附分为金属与细胞壁结合和金属离子通过膜进行运输两步［8］。微生物和它的代谢产物一定程度上都可以吸附转化重金属，不仅仅只有活细胞能够降解重金属，死亡菌株也可作为金属阳离子的生物吸附剂，但可移动的碱金属除外（例如K+）［9］。在死细胞中，细胞积累是一个被动的过程，金属可能附着在表面分子上，死亡细胞的细胞壁可能已经破裂，金属与表面分子结合时有更多可用的结合位点［10］，这使得死亡细胞对重金属的还原效率有可能比活细胞更快［11］。这是因为吸附主要发生在吸附和生物累积上，吸附发生在微生物与金属接触的最初几分钟，这个机制与新陈代谢无关，活细胞和死亡的细胞都可以发生；但在生物累积上，因为这种机制依赖新陈代谢和能量，所以死亡的细胞不能参与这一过程［12］。虽然死亡的细胞易于保存和使用，但是生物吸附和许多重金属离子的状态对pH 非常敏感，死亡细胞缺乏活跃的新陈代谢和pH 值的调节从而会降低吸附的效果，这也暴露了死亡的细胞在对污染物修复时相对于活细胞的缺陷。

固定化微生物技术对重金属的修复机制主要是：

（1）微生物对重金属的生物吸附。细胞膜所带负电荷对重金属自由离子所带正电荷的静电吸附、离子交换作用，细胞外表面进行的络合作用，细胞周围形成有利于微沉淀的环境使重金属与微生物细胞表面之间产生化学相互作用，金属阳离子和微生物形成不溶性聚集体；

（2）微生物对重金属的还原。细菌产生的还原酶将重金属还原；

（3）载体材料对重金属离子的吸附还原和离子交换作用［13-15］。总的来说，重金属是由固定化载体和微生物联合修复的。

2 固定化微生物的方法

根据微生物与载体间的结合方式，目前主要的固定化方式有吸附法、包埋法、交联法、表面结合法、絮凝法以及复合固定化法等［16-18］。

2.1 吸附法

吸附法主要是依靠载体材料的物理性质或微生物与载体之间的作用力（如氢键、范德华力等），该方法快速简便、环保经济，是生物修复过程中常用的方法。但是载体表面的吸附是通过弱键的形成来实现的，稳定性较弱，细胞比较容易从载体泄漏到环境中。

2.2 表面结合法

表面结合法分为表面静电吸附法和共价结合法。表面静电吸附与物理吸附非常相似，需要用缓冲溶液清洗载体表面，以获得亲水性表面，从而吸引带负电的细胞或酶，这种方法微生物泄漏的概率较高。共价键结合的优点是它们足够强，可以减小微生物泄漏到环境中的概率［19］，但是此方法使用的结合剂通常对细胞有毒，微生物的活力和活性多会受结合剂的影响而降低。

2.3 絮凝法

絮凝法是利用某些微生物具有自絮凝形成颗粒的特性，使微生物自固定，成为无载体的固定化技术。人工絮凝即交联法是使用交联剂使微生物细胞与带两个以上多功能团的非水溶性交联剂进行交联，可用于增强天然不絮凝的细胞的聚集。絮凝法稳定性好，但反应激烈，会使细胞活性降低。

2.4 包埋法

包埋法是较常用的一种微生物固定化方法。包埋法是将微生物包覆在高聚物载体内的固定化方法。包埋后，微生物细胞只能在载体内移动，这可以防止细胞泄漏到环境中，但也会限制营养物质和代谢物的交换，不适合大分子污染底物的去除。包埋法载体中的微生物在生理上是多种多样的，与载体内部的饥饿细胞相比，位于表面附近的细胞具有高代谢活性，生物包埋过程中最重要的参数是载体孔径与细胞直径的比值，在比值较大的情况下，它们可能会泄漏到环境中［20］。

2.5 封装法

封装与包埋非常相似，在这种方法中，固定化颗粒通过半透膜与外界环境分离，这种方法的最大优点是对微生物保护性和截留程度较好。但是该方法使用的膜渗透性有限，而且可能会被内部微生物破坏，在原位生物修复中很少使用这种方法。

2.6 复合固定化法

复合固定化法是将不同的固定化方法联合使用,这种方法不仅可以使微生物有较高的活性，而且还可以提高处理污染物的性能。例如有研究表明，在对微生物进行包埋的同时,采用交联剂对其进行交联处理，不仅使微生物细胞与细胞之间彼此连接,而且提高了系统的稳定性和处理污染物的能力［21］。这种联合的方法往往能够克服单一方法造成的局限，使各个方法协同互补从而带来更大的经济和环境效益。

3 固定化微生物的载体

3.1 载体要求

载体是固定化微生物技术实施的基础，它为微生物提供生长附着和反应的场所。选用外源微生物时需要考虑其与本土微生物进行营养元素的竞争［22］，有些载体材料还可为微生物提供营养元素，而且一些载体材料本身对重金属也有一定的吸附和修复能力，载体材料的结构性能是影响固定化微生物技术实施效果的重要因素，选择合适的高性能的载体尤为关键。

为了满足微生物和技术的需要，载体材料应具备以下特点：

（1）有一定的物理、化学和机械的稳定性；

（2）具备一定的生物相容性，对微生物无毒害，不易被微生物分解，保质期长；

（3）价格低廉，易于大批量得到或生产，易于处理和再生；

（4）具有优良的传质性能，从流动介质到载体中心有合适的扩散距离，易于微生物和代谢产物的扩散；

（5）具有较大比表面积，高细胞质量负荷能力，使得固定化细胞密度大。

3.2 载体种类

常用的固定化微生物载体按照其性质可以分为有机和无机载体，按合成方式又可分为天然或合成载体。

3.2.1 天然有机载体

天然有机载体具有许多稳定生物催化剂的官能团，常见的有海藻酸钠、玉米芯、硅藻土等，它们大多是食品工业的废物，一般这类载体具有亲水性、可生物降解、良好的生物相容性和廉价性等特点。但是这类载体对生物降解的抵抗力低，对有机溶剂敏感，并且一般只在较窄的pH 范围内稳定，导致它们在生物修复过程中应用性受限［16,23］。

3.2.2 合成有机载体

合成有机载体一般具有许多功能基团，具有多样性的特点。这一类载体包括聚丙烯、聚乙烯醇等。在合成过程中，载体的孔隙率、孔径、极性和疏水性可以得到控制，此外，合成载体可以形成各种形状（如球形、椭圆形等），而且它们容易获得相对便宜［16,24］。

3.2.3 无机载体

无机载体分为天然无机载体和合成载体，这类载体具有很高的化学、物理和生物抗性，包括火山岩、多孔玻璃、陶瓷、纳米颗粒等。这类载体的一个重要缺点是官能团较少，与微生物结合能力较弱且不能够为微生物提供养分［16,25］。

由于不同的微生物和降解的化合物对使用的载体有不同的要求，所以载体的选择是影响生物修复过程成功的关键步骤。基于材料的不同特点，可将不同种类载体材料组合成复合载体。如有研究表明将芦苇生物碳和海藻酸钠（SA）、聚乙烯醇（PVA）组合成复合载体，生物碳含有大量的孔结构和较多的含氧官能团和胺基、磺酸基、羧基和酰胺基等基团,这使该类型载体不仅具有良好的吸附性能以及较强的酸碱缓冲能力从而降低了颗粒破损率,还有利于微生物的黏附和增殖［26］。新型复合载体的研究是今后固定化微生物技术研究的一个重要方向。

4 固定化微生物技术在重金属污染土壤修复中的应用

固定化微生物技术在水处理工程领域较成熟，但其在污染土壤修复中的研究刚刚起步，有关固定化微生物技术在重金属污染土壤修复中的研究多属实验室研究。本文主要在以下三个方面对固定化微生物技术在土壤重金属污染的修复应用进行了综述：改良剂辅助固定化微生物修复、新型材料复合固定化微生物的固定、多菌株的共固定修复。

4.1 改良剂辅助修复

微生物对重金属等环境的胁迫比较敏感，在运用固定化微生物技术时通常需要添加改良剂来辅助处理污染物。有些菌株只能在低浓度下耐受重金属胁迫［27］，这就需要添加一些改良剂来辅助菌株。生物碳、腐殖质或堆肥方法等作为温和的改良剂和修复方法正弥补了这一缺陷［28-30］。

腐殖酸能够催化某些还原过程并吸附到微生物和土壤矿物上，而且腐殖酸能促进微生物胞外电子转移，在降低Cr（VI）中起关键作用［31］。Hou［32］研究了腐殖酸结合新型耐铬菌QY-1 的固铬效果，研究证实了腐殖酸对土壤本身没有明显的负面影响，综合各土壤生化指标，新型菌与腐殖酸协同对土壤生化性能的改善程度较高，对重金属的钝化率达到82.83%，腐殖酸较大的表面和营养可以为微生物的生存提供更好的保护。

许多研究已经证明了生物碳不仅具有吸附重金属的能力，而且可以增加碳源输入，从而降低重金属在土壤中的迁移率、生物利用率以及由此产生的毒性［28,33-35］。重金属能够抑制土壤微生物的生长和酶活性从而影响固定重金属的能力，但生物碳可以恢复重金属污染土壤中的微生物活性，改善了微生物的固碳效率，从而减轻对土壤微生物的生物毒性［36,37］。Liu［38］等人采用化学活化和微波辅助活化对生物碳进行改性，经活化的生物碳处理后，上层水和孔隙水的Cd 浓度分别下降71%和49%，重金属的胁迫以及镉的生物利用度降低。这些研究均表明活性生物碳是一种低成本效益高的固定重金属的原位修复材料，基于这些优点，生物碳为固定化微生物技术提供了一种有效的载体。

4.2 新型材料复合固定化微生物

单一的物理或化学修复有许多局限性，现代新型材料具有的特性和复合修复往往能够取得更好的修复效果。纳米材料由于具有表面效应、小尺寸效应等优势，成为一种前景广阔的载体材料。纳米材料对重金属也具有较好的固定化效果［39］。Tan［25］以羧甲基纤维素为稳定剂，制备了腐殖酸包覆纳米FeS，合成一种新型纳米复合载体材料，然后固定抗铬微生物菌群来处理土壤中的铬，该处理组具有较高的酶活性，说明腐殖酸能够促进土壤微生物的代谢，改善土壤质量，新型复合材料结合菌群的实验组对Cr（VI）固定化效率最高为99.16%，而且这种新型复合材料可以逐渐降低土壤的pH 值，提高土壤的自净和修复能力。Peng［40］等人研究了复合铁基纳米粒子对铅污染土壤中铅、铁有效性及微生态的影响，他发现生物碳可以改善铁基纳米颗粒的晶型和表面积，他的研究表明了纳米零价铁和生物类复合组在高浓度铅污染碱土中的修复中具有较好效果。纳米材料不能为微生物提供足够的养分，而且对某些土壤微生物活性有轻微的抑制作用，但复合固定化载体的制备降低了纳米材料的毒性，也可防止纳米材料团聚，提高纳米材料的稳定性，具有较好的修复潜力。

4.3 共固定微生物修复

与单一菌株相比，混合菌株能够执行更复杂的修复任务并在更多变的环境中生存。Kang［41］等人评估了混合细菌对铅、镉和铜的解脲活性和碳酸盐沉淀能力。与单种细菌相比，该细菌混合物具有较高的生长速率、脲酶活性，混合菌对重金属的抗性更强，细菌混合物表现出比单独培养物更高的重金属生物修复能力，这可能是由于混合培养物的不同菌株之间的协同效应造成的。混合培养物更高的修复效率反映了微生物能够更好地适应由金属毒性引起的不利环境条件，这表明混合菌是一种很有前途的修复方式，因为生物强化不是针对单一物种，而是针对能够提供更多样性和提高去除时间和效率的微生物混合物，并且现实污染中，被污染的场地往往不仅仅被一种重金属或污染物污染，混合菌的固定化性能为这一问题找到一种解决的可能方案。

5 结语

固定化微生物技术是现代生物技术与环境融合于污染控制的应用，具有二次污染小，成本低，处理效率高，微生物活性高，稳定性较强，抗冲击负荷能力强等特点，是一种比较合适前景广泛的土壤重金属污染修复方法，但是还有许多问题亟待解决：

（1）目前还处在实验室研究阶段，几乎没有现场应用的报道，现阶段大多数研究者对重金属处理的实验是在静态吸附情况，动态反应器中的吸附能力研究可能会是今后的研究重点，另外从实验室转向实际项目所面临的实验放大问题也需要考虑。

（2）固定化微生物技术需要预先专门培养驯化来获得高效能的菌种，这种方法得到的菌种其专一性很强，这些菌株通常只适合实验室小规模培养，但实际应用中可能会需要大量的菌株，而且一般污染物繁杂，目前的大多数研究的只是针对单一重金属，对多种重金属同时污染的情况研究较少，单一的针对性菌种无法做到多种污染物同时处理，寻找多功能菌株可能会是今后的研究重点。

（3）载体材料和固定化方法也是固定化技术高效进行的关键，根据实际项目环境开发改良能够容纳多种菌株的新型复合载体使之共同处理不同的污染物是今后必须面对的研究重点。

（4）相对于传统的物理化学修复方法，固定化微生物方法周期较长，寻找高效的固定化方法和菌株，使修复周期尽可能缩短也是需要考虑的一个问题。

（5）针对实际问题将传统修复技术与固定化微生物技术的联合应用或许会产生更好的效果，这或许也是今后研究的一个主要趋势。