不同生态区烟叶新植二烯含量的反吹气相色谱法检测与分析

王冰 赵乐 余晶晶 蔡君兰 丁美宙 彭斌 赵俊伟 赵晓东 秦亚琼 刘克建 刘绍锋 谢复炜

摘 要：為快速测定烟叶新植二烯含量，构建了5 m DB-5ms预分离柱结合10 m DB-5ms分析柱的反吹柱系统，确立了反吹压力103 kPa，反吹时间4.5 min的色谱条件及采用10 mL二氯甲烷涡旋提取0.5 g烟粉5 min的前处理方法，并对114个国内外代表性烟样进行了分析。结果表明：①新植二烯在10～200 µg/mL范围内线性良好（相关系数r˃0.999 9）。新植二烯定量限为16 µg/g，加标回收率在98%～101%之间，日间、日内相对标准偏差分别为1.81%和1.76%，长期（两年）相对标准偏差小于5%。每个样品分析时间仅为8 min。②将国内5个生态区烟叶与代表性进口烟叶中新植二烯含量进行对比分析，西南高原生态区烟叶与代表性进口烟叶无显著性差异;其余4个生态区（武陵秦巴、南岭丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵）烟叶与代表性进口烟叶有显著性差异。③无论从整体还是从每个生态区分析烟叶新植二烯含量，上部烟叶与中部烟叶无显著性差异，与下部烟叶相比，均有显著性差异，下部烟叶新植二烯含量较高。本研究通过反吹气相色谱-火焰离子化检测器检测烟叶新植二烯含量，所建方法简单、快速、灵敏度高、重复性好，可用于不同产区、不同部位烟叶中新植二烯含量的批量定量检测。

关键词：烟叶;新植二烯;反吹技术;气相色谱

Abstract： In order to rapidly analyze neophytadiene in tobacco leaves， a back blowing column system （5 m DB-5ms pre separation column combined with 10 m DB-5ms analysis column） was developed. Chromatographic conditions （back blowing pressure of 103 kPa and back blowing time of 4.5 min） and pretreatment method （extracting 0.5 g tobacco powder with 10 mL dichloromethane vortexing for 5 min） were established， 114 representative tobacco samples at home and abroad were analyzed. The results showed that： 1） In a range of 10-200 μg/mL， neophytadiene had good linear relationship （r˃0.999 9）. The limit of quantitation of neophytadiene was 16 µg/g. The spiked recoveries ranged from 98% to 101%， the relative standard deviations （RSD） of inter day and intra day were 1.8% and 1.76% respectively and the long-term （Two-year） RSD was less than 5%. The analysis time of each sample was only 8 min; 2） The contents of neophytadiene in tobacco leaves from five domestic ecological regions and abroad were compared， and no significant differences were found between the southwest plateau ecological region and abroad， but significant differences were observed between the other four domestic ecological regions （Wuling Qinba， Nanling hills， Wuyi hills， Yimeng hills） and abroad; 3） By analyzing the neophytadiene in tobacco leaves from the whole or each individual ecological region， no significant differences were found between the upper and middle leaves， but when compared with the lower leaves， there were significant differences and the content of neophytadiene in the lower leaves was higher. In this study， neophytadiene in tobacco leaves was detected by back blowing gas chromatography and flame photometric detector. The method was simple， rapid， sensitive and reproducible. It can be used for batch quantitative determination of neophytadiene in different parts of tobacco leaves from different production regions.

Keywords： tobacco; neophytadiene; back-flush technique; gas chromatography

新植二烯属叶绿素降解产物，是烤烟中含量最高的中性致香成分，占烟叶鲜重的0.06%～0.1%，可作为烟气气溶胶内香气物质的载体，具有携带烟叶中致香成分进入烟气的能力，是烟叶重要的增香剂[1-2]。在烟草燃烧时，新植二烯可直接进入烟气，具有减轻刺激性，醇和烟气的作用，其含量与烟气柔和性显著正相关[3];而且可进一步分解转化为植物呋喃，能显著增加烤烟的香气和吃味，对烟叶质量、香气风格有重大影响，是影响卷烟感官质量的主要影响因子之一[4]。

目前对于烟草中新植二烯的检测方法，除杨盼盼等[5]报道的近红外法快速测定初烤烟叶中新植二烯含量，其他大都是与烟草微量香味成分共同分析，存在前处理方法操作繁琐、耗时费力，上机时间较长等缺陷，且大都采用相对定量方式[6-14]。关于烟草中新植二烯准确定量检测方法的系统研究鲜有报道，尚未形成统一、规范化的标准检测方法。

本文采用有机溶剂提取烟叶中新植二烯，对提取体系、提取溶剂和提取时间进行了优化;结合气相色谱反吹技术[15-18]采用火焰离子化检测器进行检测，以期提高检测效率，为烟叶原料筛选提供技术支持和准确数据保证。

1 材料与方法

1.1 化学试剂与材料

二氯甲烷（色谱纯，美国Acros Organics公司）;正十七烷（纯度大于98%，百灵威公司）;新植二烯（纯度均>80.0%，加拿大TRC公司）。根据全国烤烟烟叶香型风格区划[19]研究结果，收集国内西南高原、武陵秦巴、南岭丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵五大生态区上、中、下3个部位烟样99个及巴西、津巴布韦、美国代表性烟叶11个，所选烟叶样品均为2018年烟叶样本。

1.2 设备

6890A气相色谱仪[配有氢火焰离子化检测器（FID）和压力控制模块（PCM），美国 Agilent Technologie]、SRL-3.7MB5C无油式螺杆空压机（南京日立产机有限公司）、450cc氢气发生器（英国PEAK）、精密电子天平（感量0.0001 g，德国Sartorius）、数显型旋涡混合器（美国TALBOYS Advanced Multi-Tube Vortexer）、LC-223鼓风干燥箱（上海爱斯佩克环境设备有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 样品处理 烟叶晾干后粉碎，过40目筛，室温装于封口袋中备用。按照YC/T 31—1996行业标准检测烟样含水率。称取0.5 g烟粉于50 mL离心管，加入50 µL正十七烷内标溶液（内标物浓度为10 mg/mL）及10 mL二氯甲烷溶液，2500 r/min条件下涡旋提取5 min，10 000 r/min下离心3 min，取上清液过2 µm有机相滤膜于一1.5 mL色谱瓶中，等待BF-GC-FID分析。

1.3.2 标准工作溶液配制 称取0.1 g正十七烷于10 mL容量瓶中，用二氯甲烷定容，配成内标溶液。

将10 mg新植二烯溶于10 mL容量瓶中并用二氯甲烷定容，配成标准储备液。分别取100、200、500 µL，1、2 mL储备液于5个10 mL容量瓶中，并分别加入50 µL内标溶液，配制成5级标准工作溶液，标线浓度范围为10～200 µg/mL，内标浓度为50 µg/mL。

1.3.3 反吹气相色谱质谱条件 色谱柱1：DB-5ms （5 m×0.25 mm，0.25 μm）;色谱柱2：DB-5ms（10 m×0.25 mm，0.25 μm）。载气：N2;进样口温度：280 ℃;进样量：1 μL;分流比为20∶1。进样口压力：131 kPa（保持4.5 min），然后以683 kPa/min速率降至34 kPa（保持3.5 min）。PCM压力：103 kPa。升温程序：初温100 ℃，以20 ℃/min的升温速度升到200 ℃，再以90 ℃/min的升温速率升至290 ℃，保持3 min。FID参数：温度300 ℃，氢气流量40 mL/min，空气流量400 mL/min，尾吹流量25 mL/min。

1.3.4 数据处理 样品数据为扣除水分后以干质量计含量。运用Excel 2010对原始数据进行标准化处理，运用SPSS Statistics 17.0对样品新植二烯含量进行单因素方差分析。

2 结果与讨论

2.1 反吹装置介绍

反吹装置如图1所示，预柱、分析柱及PCM（压力控制模块）通过微流控三通相连。当进样口压力大于PCM压力时，载气流路如图1A所示，化合物通过预柱及分析柱，进入FID检测器。当进行反吹时（图1B），PCM压力大于进样口压力，目标化合物通过预柱、分析柱后进入FID，而不需要分析的化合物在载气的带动下，通过预柱，从进样口反吹出去;通过反吹，在新植二烯后出峰的物质均被吹出，不再进入分析柱及检测器。

2.2 氣相色谱条件优化

2.2.1 无反吹时样品分离效果 采用色谱柱1（DB-5ms：5 m×0.25 mm，0.25 μm）为预柱，色谱柱2（DB-5ms：10 m×0.25 mm，0.25 μm）为分析柱进行预试验，通过安捷伦Mass Hunter工作站自带的压力流量计算器计算可得，当进样口压力为131 kPa，PCM压力为103 kPa，炉温在100～200 ℃时（根据文献[5]可知，新植二烯大约在200 ℃出峰），预柱与分析柱流量均为2～3 mL/min，可以实现快速分析新植二烯的预想。因此，设定进样口压力为131 kPa，PCM压力为103 kPa，采用1.3.3中的程序升温条件，进行预试验，结果（图2）表明，该系统下可实现样品中新植二烯的基线分离;但柱系统中有大量杂质，需要高温烘烤才能洁净分析系统，以进行后续分析工作。

为了提高分析效率，可采用反吹技术。该技术的使用不仅可洁净分析系统，增加其稳定性，延长分析柱寿命，而且可节约分析时间，提高分析效率。

2.2.2 反吹时间优化 由预试验结果可知，不反吹时新植二烯出峰时间约为5.2 min，因此，分别将反吹时间设为3、4、4.5、5 min，即当分析时间为3、4、4.5、5 min时，将进样口压力由131 kPa迅速调至34 kPa，PCM压力仍为103 kPa。通过安捷伦MassHunter工作站自带的压力流量计算器计算可得，预柱流量约为6 mL/min，分析柱流量约为2 mL/min，此时，既实现了快速反吹，又使分析柱保持了预期流速。将预试验中进入分析柱的化合物通过反向吹扫，使之从进样口出口快速吹出，不再进入分析柱及检测器，吹扫时间3.5 min。试验结果（图3）表明，3 min反吹，内标尚未进入分析柱;4 min反吹，新植二烯尚未进入分析柱;4.5 min反吹，内标与新植二烯均进入分析柱，且达到基线分离;5 min反吹，已有杂质进入分析柱。因此，选择4.5 min为反吹时间。整个分析过程8 min即可完成。

2.3 前处理方法优化

2.3.1 提取体系选择 采取直接提取和泡发提取两种体系进行試验：①以二氯甲烷10 mL提取0.5 g干烟粉;②称取0.5 g干烟粉，加入1 mL蒸馏水泡发10 min，以二氯甲烷10 mL进行提取。每组试验平行3次。试验结果表明（图4），采用二氯甲烷对干烟粉中新植二烯的提取量比对泡发后烟叶的提取量高约15%。

2.3.2 提取溶剂选择 考察了二氯甲烷、正己烷、甲基叔丁基醚3种溶剂的提取效果，每种溶剂平行试验3次。结果表明（图5），二氯甲烷的提取效果最好，新植二烯含量为1.20 mg/g，甲基叔丁基醚的提取效果最差，新植二烯含量为1.06 mg/g。

新植二烯学名为3-亚甲基-7，11，15-三甲基十六碳烯，是含有3个甲基、1个亚甲基的长链烯烃。由此可知，该物质具有弱极性，根据相似相容原理，具有弱极性的二氯甲烷比无极性的正己烷对新植二烯具有更高的提取效率，而甲基叔丁基醚的提取效率最低可能是由于其空间位阻所致。

2.3.3 提取料液比选择 分别用10 mL二氯甲烷提取0.2、0.5、1.0、2.0 g烟粉，每个称样量平行试验3次。结果表明（图6），用10 mL二氯甲烷提取0.2、0.5、1.0 g烟粉时，新植二烯提取完全，计算结果均为1.20 mg/g，用10 mL二氯甲烷提取2.0 g烟粉时，计算结果为1.18 mg/g，略有降低。因此当用10 mL二氯甲烷提取烟叶中的新植二烯时，选取0.5 g为烟粉的称样量，此时可保证提取完全。

2.3.4 提取时间优化 考察了提取5、10、15、20、25 min时新植二烯的提取效果，每个时间点平行试验3次。结果表明（图7），提取时间分别为5、10、15、20、25 min时，用10 mL二氯甲烷提取0.5 g干烟粉，烟粉中新植二烯的提取量是一致的，并没有随着提取时间的增加而增加，说明5 min即可完成对新植二烯的提取。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线、检出限及定量限 将配制的系列标准工作溶液进行BF-GC-FID分析，采用内标法定量。以新植二烯与内标物的响应面积比为纵坐标，浓度比为横坐标作图（图8），得到新植二烯的线性回归方程及相关系数。将最低浓度的标准溶液重复进样10次，分别以测定结果标准偏差的3倍和10 倍确定方法的检出限和定量限。结果显示，新植二烯的标准工作曲线线性关系良好（浓度范围为10～200 µg/mL），相关系数平方为1;检测限、定量限分别为4.90 μg/g、16.00 μg/g，远低于烟叶提取液中新植二烯的质量分数，满足对烟叶中新植二烯分析的检测要求。

2.4.2 精密度及回收率 选取典型烤烟样品，连续5 d进行试验以考察方法日间精密度;同一天内，以相同前处理方法进行6次平行试验，以考察方法日内精密度。以实际样品含量为参考，根据新植二烯在烟末中含量的0.5、1、2倍进行低、中、高加标回收率试验。结果表明，方法日间、日内相对标准偏差分别为1.81%和1.76%，新植二烯回收率在98%～102%。采用该方法，历时两年多，进行了2000余个烟样中新植二烯含量的分析，监控烟样相对标准偏差小于5%。

2.5 样品分析

2.5.1 不同产地烟叶新植二烯含量分析 采用所建立的方法对武陵秦巴、南岭丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵、西南高原五大生态区上（B2F）、中（C3F）、下（X2F）3个部位99个烟样及11个代表性进口烟叶新植二烯含量进行分析。测定结果（表1、图9）表明：①所有烟样可分为2组：西南高原生态区烟叶与代表性进口烟叶为一组，其新植二烯含量没有显著性差异（p=0.211），均值分别为0.83、0.79 mg/g，变异系数分别为17.44%、17.82%。武陵秦巴、南岭丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵4个生态区烟叶为一组，其新植二烯含量无显著性差异（p = 0.472），均值含量分别为1.00、1.08、0.97、1.03 mg/g，变异系数分别为18.48%、15.08%、12.94%、12.85%。②两组烟样间新植二烯含量有显著性差异（p<0.001）。西南高原生态区烟叶与代表性进口烟叶新植二烯含量均值为0.81 mg/g，其余4个生态区烟叶新植二烯含量均值为1.02 mg/g，前者比后者低约21%。

2.5.2 不同部位烟叶新植二烯差异分析 对武陵秦巴、南岭丘陵、武夷丘陵、沂蒙丘陵、西南高原五大生态区上（B2F）、中（C3F）、下（X2F）3个部位99个烟样新植二烯含量进行分析。结果（表2、图10、图11）表明，①总体来看，上部烟叶与中部烟叶新植二烯含量无显著性差异（p=0.125）;上部烟叶、中部烟叶与下部烟叶相比均有显著性差异（p<0.001）。上、中、下3个部位新植二烯均值含量分别为0.88、0.93、1.13 mg/g，变异系数分别为16.12%、14.30%、13.60%。下部烟叶新植二烯含量均值较高，与上部、中部烟叶相比，新植二烯含量约高25%。②每个生态区上、中、下3个部位烟叶新植二烯含量分析结果与总体烟样分析结果趋势相同，上部烟叶与中部烟叶新植二烯含量无显著性差异，与下部烟叶相比，均有显著性差异，下部烟叶新植二烯含量较高。

3 结 论

通过对前处理条件及气相色谱条件的优化，建立了采用10 mL二氯甲烷涡旋提取0.5 g烟粉5 min的前处理方法，构建了5 m DB-5ms预分离柱结合10 m DB-5ms分析柱的反吹柱系统，确立了103 kPa为反吹压力，4.5 min为反吹时间的分析条件。样品分析表明，国内五大生态区烟叶与代表性进口烟叶相比，仅西南高原生态区烟叶与代表性进口烟叶新植二烯含量较为接近;上、中、下3个部位烟叶相比，上部、中部烟叶新植二烯含量显著低于下部烟叶。本研究建立的烟叶新植二烯检测方法，前处理简单、定量准确、重复性好，适合大量烟样中新植二烯定量分析，为烟叶原料筛选、烟叶生态环境及加工工艺条件研究提供了技术支持。

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