添加不同浓度黑曲霉菌液对饲用苎麻混合青贮品质影响

邓荟芬, 刘 艳, 揭红东, 马玉申, 何鹏亮, 黄丽娟, 林子群,邢虎成, 揭雨成*

(1. 湖南农业大学苎麻研究所，湖南 长沙 410125；2.湖南省草类作物种质创新与利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410125；3. 湖南生物机电职业技术学院，湖南 长沙 410127)

苎麻(Boehmerianivea) 是荨麻科苎麻属多年生作物[1]，是传统的纤维作物。在我国南方，高蛋白饲草缺乏，严重制约着畜牧业的发展。苎麻的蛋白质含量高，年生物产量大，有望成为今后重要的植物蛋白质饲料来源[2]。但是，苎麻含有大量木质纤维素，工业化加工困难，动物消化吸收困难，寻求能高效降解苎麻木质纤维素的方法至关重要。青贮是对苎麻安全保存的有效方法，并且在发酵过程中可以进行木质纤维素的生物降解。青贮过程中添加纤维素酶制剂，可以降解木质纤维素含量，提高家畜利用效率[3]。但是酶制剂成本高，降解效果有限[4]，不适于大规模生产使用。

近年来，高产纤维素酶微生物的研究受到高度关注。曲霉菌属是丝状真菌中著名的高产纤维素酶菌属之一，黑曲霉(Aspergillusniger)属于曲霉菌属，在发酵过程中能产生纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、木质素降解酶等多种酶[5-6]，多种酶共同作用可以高效降解生物质，且安全、无毒素。任付平等[7]通过添加黑曲霉菌等对玉米(Zeamays)进行青贮，处理组中性洗涤纤维(Acid detergent fiber,ADF)和酸性洗涤纤维(Neutral detergent fiber,NDF)的含量比对照组分别降低了13.81%和12.67%。

刘洋等[8]在苜蓿(Medicago)鲜草中添加麦麸进行青贮可以控制青贮水水分，提高营养品质，ADF和NDF含量显著低于添加统糠的处理，本试验在混合青贮中通过添加麦麸来调节青贮原料的含水量。本研究通过添加不同浓度(质量体积比)黑曲霉菌液对饲用苎麻与麦麸进行混合发酵，探究不同浓度黑曲霉菌液对饲用苎麻青贮营养成分、品质和木质纤维素降解效果的影响，寻求黑曲霉菌液最佳添加量，并通过研究在发酵过程中主要几种相关酶活的动态变化，为黑曲霉菌在青贮中降解植物木质纤维素的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验青贮苎麻原料为‘湘饲纤兼用1号’，在湖南农业大学耘园基地种植。收割时间2018年5月20日，刈割高度株高60 cm左右，全株切碎至1～2 cm待用。麦麸由临泉县金禾面粉有限公司生产，白砂糖购自湖北惠林食品有限公司，青贮原料营养成分见表1。黑曲霉由本实验室提供。

表1 青贮原料营养成分Table 1 Nutrition content compositions of ensilage materials

1.2 试验设计

本试验采用单因素完全随机设计。在每千克苎麻与麦麸(80%苎麻+18%麦麸+2%蔗糖)混合青贮中分别添加50 mL黑曲霉菌液(浓度为5.68×106CFU·mL-1)+150 mL无菌水(Ⅰ)、100 mL黑曲霉菌液+100 mL无菌水(Ⅱ)、150 mL黑曲霉菌液+50 mL无菌水(Ⅲ)、200 mL黑曲霉菌液(Ⅳ)、200 mL无菌水为对照组(CK)，每组6个重复。

按最佳处理配方将青贮材料混合均匀后装入青贮袋中，抽真空后封口。常温下青贮0 d，1 d，2 d，3 d，4 d，5 d，6 d，7 d，15 d，30 d后开包，对青贮材料进行酶活检测，每个时间点测定3个重复。

1.3 试验方法

马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar，PDA)液体产酶培养基组成：麸皮40 g·L-1，豆粉饼15 g·L-1，(NH4)2SO45 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，MgSO4·7H2O22 g·L-1。将黑曲霉菌用接种环接种到PDA液体培养基中，放置于振荡培养箱中32℃，170～180 r·min-1培养6 d。

黑曲霉计数：在接种液中加入玻璃珠，振荡器振荡后用3层纱布纱布过滤，过滤得到孢子悬浮液，然后用无菌水对其逐级稀释，采用血球计数板计数得到黑曲霉孢子浓度。黑曲霉菌液浓度为5.68×106CFU·mL-1。

培养结束后1～2 h内将不同浓度黑曲霉菌液均匀喷洒在青贮料上并搅拌均匀，青贮材料放入聚乙烯真空袋中抽真空密封后进行发酵。每袋400 g，室温条件下发酵30 d后开包进行检测。

1.4 测定项目及方法

干物质(Dry matter,DM)、粗脂肪(Ether extract,EE)、粗蛋白(Crude protein,CP)含量检测方法参照《饲料分析及饲料质量检测技术(第4版)》[9]。蒽酮比色法[10-11]测定可溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrates,WSC)。范氏洗涤纤维法[12-13]测定酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber,ADF)、中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗涤木质素(Acid detergent lignin,ADL)含量。

利用pH计(雷磁PHS-3C型)测定pH[14]；氨态氮(Ammoniacal nitrogen,NH3-N)采用苯酚-次氯酸比色法测定[15]；气相色谱法测定挥发性脂肪酸(Volatile Fatty Acid,VFA)[16]；参照V-Score评分体系及V-Score分数分配计算标准对各处理进行评分[17]。对不同发酵时间的青贮进行酶活检测。青贮羧甲基纤维素酶(Carboxymethyl cellulose,CMC)活性检测方法参考索莱宝CMC活性检测试剂盒说明书；锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,Mnp)活性检测方法参考索莱宝Mnp活性检测试剂盒说明书；漆酶活性检测方法参考索莱宝漆酶活性检测试剂盒说明书；木聚糖酶活性检测方法参考索莱宝木聚糖酶活性检测试剂盒说明书。

2 结果与分析

2.1 添加不同浓度黑曲霉菌液对苎麻青贮营养品质的影响

由表2可知，与对照组相比，各处理组的DM，WSC含量都有显著升高(P<0.05)，且处理Ⅰ组、处理Ⅱ组DM，WSC含量显著高于处理Ⅲ组和处理Ⅳ组(P<0.05)；各处理组与对照组间CP及EE含量无显著差异；与对照组相比，处理Ⅱ组、处理Ⅲ组和处理Ⅳ组的ADF，NDF和ADL含量显著降低(P<0.05)。

表2 各处理青贮饲料营养成分含量Table 2 Nutrition composition of silage in each treatment

2.2 添加不同浓度黑曲霉菌液对苎麻青贮青贮品质的影响

由表3可知，与对照组相比，处理Ⅰ组、处理Ⅱ组、处理Ⅲ组和处理Ⅳ组pH值都显著降低(P<0.05)，且所有处理组都小于4.2，符合优良青贮的要求；与对照组相比，各处理组的LA含量显著增加(P<0.05)、AA含量和氨态氮/总氮比值显著降低(P<0.05)；对照组和各处理组间的PA含量无显著差异；对照组和各处理组在发酵过程中均未检测到BA；各处理组V-Score评分都在90分(良好水平)以上，高于对照组。

表3 各处理青贮饲料发酵品质比较Table 3 Comparison of fermentation quality of ramie silage in different treatments

2.3 添加10%黑曲霉菌液进行苎麻混合青贮不同时间酶活性的变化

对添加10%黑曲霉菌液的苎麻混合青贮0 d，1 d，2 d，3 d，4 d，5 d，6 d，7 d，15 d，30 d锰过氧化物酶(MnP)、漆酶、羧甲基纤维素酶(CMC)和木聚糖酶4种酶的活性进行检测。由图1中A～D可知，MnP活性在0 d为344.24 u·L-1，在发酵前7 d持续下降，且下降幅度较大，第7 d比初始酶活下降了78.90%，15 d以后MnP活性基本维持稳定状态，第30 d MnP活性为24.23 u·L-1，比初始值下降了92.96%；漆酶活性在第0 d为26.04 u·mL-1，第1 d比初始值升高了162.29%，第1 d以后酶活开始下降，第7 d比第1 d酶活下降了78.95%，第7 d比初始值下降了44.78%，15 d以后下降速度大幅减缓，第30 d漆酶活性为14.31 u·mL-1，比初始值下降了45.04%；木聚糖酶在第0 d为 19.42 u·mL-1，发酵第1 d比初始酶活小幅上升了11.12%，第1 d以后开始下降，第7 d比初始酶活下降了54.43%，15 d以后木聚糖酶下降速度减缓，第30 d木聚糖酶活酶活为3.39 u·mL-1，比初始值下降了82.54%；CMC活性在0 d为98.48 u·mL-1，发酵前7天持续下降，且下降幅度较大，第7 d比初始酶活下降了76.72%，15 d以后CMC活性持续下降，但下降幅度减缓，第30 dCMC活性为8.31 u·mL-1，比初始值下降了91.56%。

图1 不同发酵天数苎麻青贮中酶活性差异Fig.1 Differences in enzyme activities in castor silage under different fermentation days

3 讨论

3.1 添加不同浓度黑曲霉菌液对苎麻青贮营养成分影响

黑曲霉在有氧发酵过程中可产生丰富的胞外酶，本试验检测到的有CMC，MnP、漆酶和木聚糖酶(半纤维素酶)。纤维素酶和木聚糖酶(半纤维素酶)有降解NDF和ADF的作用，可以把植物细胞壁的纤维素分解为单糖和双糖[18]；MnP、漆酶等是主要的木质素降解酶[19]。张雪蕾等[20]通过添加纤维素酶进行苎麻青贮，发现随着纤维素酶添加水平的增加，苎麻青贮中的NDF和ADF呈下降趋势。本研究结果显示，与对照组相比，添加了黑曲霉的各处理组WSC含量显著升高，NDF，ADF和ADL含量不同程度降低，并且处理Ⅱ组、处理Ⅲ组、处理Ⅳ组明显优于处理Ⅰ组对NDF，ADF和ADL的降解效果，可能是由于处理Ⅰ组中胞外酶的总量较少，所以降解效果较差。处理Ⅱ组、处理Ⅲ组和处理Ⅳ组NDF，ADF和ADL的降解效果无明显差异，推测是因为黑曲霉菌液添加量超出10%以后，各种酶的降解作用已发挥到极限，黑曲霉菌液的添加量与NDF，ADF和ADL的降解效果无正相关性。

3.2 添加不同浓度黑曲霉菌液对苎麻青贮发酵品质的影响

目前，青贮主要是添加乳酸菌作为发酵促进剂，在厌氧环境中通过乳酸菌的繁殖产生酸性环境，使青饲料得以长久保存。我们通过多次预试验证明，在不添加乳酸菌情况下，苎麻青贮仍可在短期内形成酸性环境，且各组的pH均在4.2以下，符合优质青贮饲料的要求[21]，推测苎麻本身带有丰富的乳酸菌。处理组pH值显著低于对照组，可能是黑曲霉产生的纤维素酶和木聚糖酶等能将植物细胞壁的纤维素分解为乳酸菌繁殖提供所需营养，从而提高了LA的含量使pH值降低。任付平等[7]利用微生物对玉米进行青贮，发现黑曲霉等微生物将玉米中的纤维降解为寡糖和单糖，为菌体生长提供丰富的营养环境，从而提高了LA的含量。魏晓斌等[22]通过添加乳酸菌和纤维素酶对苜蓿进行青贮，发现添加乳酸菌和纤维素酶可以弥补苜蓿原料乳酸菌与可溶性糖不足，显著提高LA含量，显著降低AA含量。李顺等[23]通过添加糖蜜和纤维素酶对籽粒苋(Amaranthushypochondriacus)进行混合青贮，能极显著降低籽粒苋与麦麸混合青贮的NH3-N/TN值。本试验中，我们通过添加黑曲霉及菌液补充了复合酶，与对照组相比，各处理组提高了LA含量、降低了AA含量；与对照组相比，处理组因添加黑曲霉及菌液在复合酶的作用下NH3-N/TN值显著降低，与前人的研究结果一致。

3.3 添加黑曲霉菌液进行苎麻青贮对不同时间酶活性的影响

黑曲霉为好氧菌，青贮发酵早期大量繁殖，产生大量分解底物的酶类物质，迅速消耗原料中的氧气，使青贮饲料进入无氧状态，菌体的活动还可以提高青贮料的温度，从而抑制其它好氧腐败菌在青贮料中的生长繁殖[6]。在本研究中，漆酶和木聚糖酶在发酵第一天有不同程度的上升，说明黑曲霉在发酵初期利用了青贮袋中残留的氧气进行了有氧发酵产生了胞外酶。左飒飒等[24]利用白腐菌进行玉米秸秆的降解，在有氧条件下进行发酵，木质素及纤维素酶都随着发酵时间的延长而升高。本研究在发酵初期也因少量氧气存在，漆酶和木聚糖酶有酶活升高的现象，而后随着时间的延长持续下降；CMC，MnP活性在发酵过程中持续下降。黑曲霉为好氧菌，随着发酵时间的延长，氧气被耗尽，无法进行发酵产生胞外酶，故酶活力逐步降低[25]。但4种酶在发酵30 d时仍有少量存在，对混合青贮的木质纤维素降解起到了关键作用。

4 结论

通过添加黑曲霉菌液对饲用苎麻进行青贮，不同程度降低了混合青贮中的NDF，ADF和ADL，提高了苎麻青贮的发酵品质。降解效果以处理组Ⅱ(即每千克混合青贮中添加100 mL黑曲霉菌液+100 mL无菌水)为最佳。黑曲霉在青贮前期短暂时间内有氧条件下使漆酶和木聚糖酶酶活有所上升，后期各酶酶活持续下降，15 d后下降幅度趋缓慢。黑曲霉是苎麻进行青贮发酵的优良促进剂，可提高发酵饲料品质。