B 族链球菌在围产期妇女的情况和血清型分型研究进展

覃德明综述；胡龙华审校

(江西省妇幼保健院，江西 南昌 330000)

B 族链球菌是革兰阳性球菌，在全球的妊娠妇女GBS 携带率为11%～35%[1,2]，我国GBS 阳性定值率3.5%～32.4%[3]，由于地域性差异、种族、卫生条件和筛查方法等因素, 使得不同地区孕妇GBS 阳性率变化很大。 围产期孕妇感染GBS 会导致孕妇早产、晚期流产、胎膜早破、死产[4]、产褥热和败血症等疾病[5-7]。若无干预措施，约50%的GBS 携带孕妇会将细菌传播给新生儿[8],导致新生儿发生肺炎、败血症、脑膜炎等严重疾病[9,10]。 一般新生儿感染分为早发型（从出生到第6 天）和晚发型（7 天至89天）[11-13]。 早发型[14,15]占新生儿GBS 感染的80%～90%，且多是垂直传播，一般多表现为肺炎和败血症。 迟发型，有多种途径感染，如早发型未治愈复发、水平传播等，主要表现为败血症、脑膜炎，可有致死性和神经症状等后遗症[16]，所以预防GBS 感染非常的重要。

目前全世界绝大多数国家是采用美国妇产科学会和儿科学会指南[17]进行孕35 周至37 周妇女筛查，GBS 阳性孕妇进行药物[18]干预治疗，对情况不明的孕妇采用风险评估策略而预防性用药。 国外对孕妇筛查GBS 非常重视，我们国家近几年也开始重视孕妇GBS 筛查，为了提高检查的准确率，临床除传统的细菌培养外，不段引入新的检测方法，如显色平板培养法、实时荧光PCR、微滴数字PCR 检测方法等。 现对目前临床上孕妇产前GBS筛查的方法学进行归纳总结，和GBS 血清型分型情况进行阐述以便找到合适临床筛查方法以及血清型与GBS 感染的关联性。

1 B 族链球菌的微生物学特征

B 族链球菌，革兰阳性球菌，呈单、双或3～8 个串珠状排列。 链的长短与培养环境相关，在液体培养基中生长良好，链相对较长。 无芽孢，无鞭毛，无动力，有菌毛，有荚膜且与致病性密切相关。 兼性厌氧，营养要求较高，一般初次分离要在5%～10%CO2环境中生长良好，最适生长温度35℃，pH 值7.4～7.6。 在羊血琼脂平板上形成灰白色、凸起、中等大小、湿润、边缘整齐，绝大多数呈狭窄溶血，极少数菌株不溶血，少数菌株产黄色色素。3%过氧化氢触酶试验阴性，CAMP 协同试验阳性，马尿酸钠水解试验阳性，6.5%NaCL 不生长。

依据GBS 表面的荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）抗原成分将GBS 分成10 个血清型[11,19,20]（Ia、Ib、Ⅱ….Ⅸ）,不同国家、地区流行的血清型有所不同[21]。 在国内Ia、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型较为常见[22]，其中Ⅲ型[11]在新生儿侵袭性病例中分离较多，证明其致病力较其他血清型强。

同时，GBS 表面有多种蛋白组成，如荚膜多糖、Sip 蛋白和α 蛋白，还可以分泌一些酶[23,24]等，这些都是重要的毒力因子和分型的主要依据，在定值、粘附和感染等过程起关键性作用。

2 目前临床GBS 筛查方法

依据美国疾病预防控制中心指南，对所有孕35W～37W 妇女均要进行GBS 筛查，由于GBS 在直肠生殖道的定值呈现慢性携带、 间歇性带菌和短暂携带[25,26]，所以需要多种筛查方法比对，找出敏感性高和特异性强的方法用于临床至关重要。 目前常用的筛查方法学有：传统培养法、显色平板培养法、实时荧光PCR、微滴数字PCR 检测方法、免疫层析法和等温lamp 法等[27]。

2.1 传统培养法

2.1.1 操作方法 培养法是依据《临床微生物操作手册》，由医师或经过培训的护士，清洁孕妇外阴，然后拧开已贴患者信息条码的灭菌拭子管，使用棉拭子在阴道下段1/3 处旋转2～3 圈，然后将拭子插回无菌套管里； 拧开另一根也已贴患者条码信息的灭菌拭子，用棉拭子在离肛门口2～3cm 处直肠旋转2～3 圈，然后将拭子插回套管。 于2h 内将标本送到实验室及时接种，以免长时间可能导致细菌死亡，造成假阴性结果。 将标本接种在羊血琼脂平板上，分区划线，放35℃，5% CO2温箱培养16～18h，根据菌落形态，溶血现象、触酶，CAMP 试验，然后再进行血清凝集鉴定或API 链球菌板条或采用全自动微生物分析仪进行菌种鉴定。

2.1.2 优缺点 培养法是 “金标准”[28]，有较好敏感度和较强特异性，灵敏度和特异度分别是36.36%～73% ，98.24%～100%，且价格便宜，但耗时较长，需要专业人员且具有一定经验才能完成，一般需要24～48h 出结果，且还易受取样、送检时间等因素影响检出率。

2.2 显色平板培养法

2.2.1 操作方法 取样和标本接种方法同培养方法，将标本接种于显色平板上[29]，分区划线，放普通温箱35℃，16～18h。 若平板上菌落为红色或紫红色则提示可能为GBS，然后进行菌株鉴定确认。

2.2.2 优缺点 显色平板能非常直观提示GBS 菌株，且平板添加了抑制剂，可以抑制一些杂菌的生长。 但是少部分不产生色菌的菌株易漏检。

2.3 实时荧光定量PCR[30-33]

2.3.1 操作方法 取样同培养法，国外或国内部分实验室将取样的标本插入Todd Hewitt 选择培养基35℃，16～18h 增菌后，再进行PCR 检测。 但国内大多数实验室是直接将已取标本拭子，按试剂盒说明书操作。 ⑴细菌DNA 提取，⑵将DNA 模板加入反应体系，⑶采用专用的荧光PCR 仪，进行DNA扩增和收集荧光信息，依据荧光曲线自动判断阴阳性结果。

2.3.2 优缺点 PCR 技术[34]也是在不断发展中，之前的常规PCR 是以GBS 的蛋白基因、16S-23S 沉默区基因、 编码氨基酸转运蛋白-gs0538 的atr 基因、sip[35]基因等作为靶基因，目前大多实验室或临床使用的快速筛查GBS 方法都是以编码CAMP 因子的cfb 为靶基因试剂盒。 它实现了 “快”“准”“狠”的特性，体现在检测时限短，1h 左右可完成；敏感度较高（85%～98.5%）； 超强的特异性（97.6%～99.6%）。 如能实现自动化，可进行床旁检测。 全程反应在单管进行，无需产物分析，又避免了实验室的污染。 但设备和试剂成本大，有较高技术含量，对经济欠发达的地区来说无疑是增加了经济负担。 不过从综合角度考虑，能尽早筛查出GBS 减少疾病导致的不良后果，其成本效应[36]是否可以相互抵消？

2.4 微滴数字PCR 检测方法[37,38]

2.4.1 操作方法 实验前的临床取样同培养法：⑴将样品在微滴发生器里进行微滴化处理，形成油包水分散微滴体系； ⑵将该液体转移至PCR 反应微孔进行独立DNA 扩增；⑶结束后微滴分析仪进行荧光信号收集，经泊松分布原理进行样品浓度计算。

2.4.2 优缺点 该方法是一种新型GBS 筛查方法，无需依靠标准曲线的定量，微滴化处理减少了杂质的污染，且能对低拷贝数的样本进行检测，灵敏度（93.1%～99.37%）高和特异性（84.39%～97.2%）强。 但相对于培养法，成本无疑更高，相对于荧光PCR，操作步骤要繁琐些。

2.5 免疫层析法[39]

2.5.1 操作方法 临床取样同培养法，⑴抗原提取，⑵将标本滴入抗原检测试剂卡，⑶根据检测卡出现两条红线，判读为GBS 阳性。

2.5.2 优缺点 该方法操作简单，快速，不需要大型设备，不受标本送检时间限制，可以灵活检测。 但敏感性变化很大，易受到取样方式和带菌量等影响。 特异性也与抗体纯度有关，易受到干扰。 申旺[40]等作者用免疫层析法筛查GBS 敏感度97.5%，特异度为97.54%，而另有研究数据显示，远低于上述数据，可能不同地区GBS 流行率不同、与选取的标本等因素相关。

2.6 环介导等温扩增（LAMP）[41,42]

2.6.1 操作方法 临床取样同培养法，进行DNA 提取，利用靶基因设计的特异引物，链置换型BstDNA 合成酶，在60～65℃环境下进行扩增反应，依据颜色变化肉眼判读结果。

2.6.2 优缺点 该方法敏感性为92.2%，特异性为95.6%，不需要昂贵的扩增仪，快速、便捷，一般可在一小时完成标本检测。 不足之处是引物设计较复杂，试剂成本较贵。

综合以上方法的优缺点，兼顾不同地区、不级别医院的实际情况，可选择不同的筛查方法，一般经济发达的地区和大医院适合开展普通培养联合实时荧光PCR 或介导等温扩增。 培养法最大的优势是可以检测细菌同时还可以进行药物敏感测试，指导临床用药。 实时荧光PCR 敏感度高，特异性强，可以快速筛查，特别是对那些未能按时产假的孕妇进行实时检测，以了解孕妇带菌情况，又可避免仅依据风险评估用药导致的过度用药。 而在经济欠发达地区和小型医疗机构可以选择胶体金法，简便快捷。

3 妊娠妇女GBS 携带率和血清型分布及菌株耐药情况

北京[43]地区孕妇GBS 阳性定值率为5.18%，以Ⅲ型血清型占主要（41.7%），其次为Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ型；菌株对一线药青霉素、头孢噻肟敏感，对红霉素和克林霉素的耐药率分别为71%和69%。上海[44]地区孕妇的GBS 阳性定值率为3.72%，以Ⅲ型（32.2%）血清型为主，同时还有Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅴ型；菌株对红霉素、 克林霉素及左氧氟沙星的耐药率分别为63.37%，3.48%和25.13%。 广州[45]地区孕妇GBS 定值率为6.33%；血清型主要为Ⅲ型，同时有Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ型；菌株对红霉素和林霉素的耐药率分别为50.6%和47.8%。 深圳[46]地区孕妇GBS 定值率为4.5～4.9%，血清型以Ⅲ型（56.1%）为主，同时有Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅴ型。 菌株对四环素、红霉素、克林霉素、 左氧氟沙星的耐药率分别为76.9%、72.1%、66.4%及27.8%。 江西地区[47,48]的GBS 定值率为10.21～21.5%, 菌株对红霉素耐药率为45～96.03%，对克林霉素耐药率26～35.1%，未找到血清型分型的相关文献。 结果表明，国内孕妇携带的GBS 以血清Ⅲ型为主，菌株对青霉素几乎全部敏感，但对红霉素和克林霉素耐药率较高，应引起重视。

韩国[49,50]孕妇GBS 阳性定值率为10～17.3%，III 型血清型为主，其他型为Ia,Ib,Ⅱ,IV、V 和VI，菌株对红霉素和克林霉素耐药率分别为19.1%和33.3%。 非洲地区[51]孕妇的GBS 阳性定值率为19.3%，V 型（29.2%）血清型为主, 其他型为III, Ia,Ib 和II，菌株对红霉素和林霉素耐药率分别为20.82%和19.63%，分离到对青霉素耐药菌株。在西澳大利亚[52]孕妇的GBS 阳性定值率为24%，血清型Ia（27.9）为主，其他血清型有III、Ⅱ、V、Ib、VI、IV，菌株对红霉素和林霉素耐药率分别为6.4%和4.2%，未检出对青霉素耐药菌株。 瑞士[53]孕妇GBS阳性定值率为21%，血清型以Ⅲ型为主，其他型有V 和Ia； 菌株对红霉素和克林霉素耐药率分别为14.5%和14%。 在美国[54]孕妇的GBS 阳性定值率为10%～30%，血清型Ia 和III 型最常见，其他型分别是Ib、II、III、IV 和V； 菌株对红霉素和克林霉素耐药率分别为32%和20%。

全球孕妇GBS 的定值率为18%，国内大部分城市孕妇GBS 定植率要低于全球平均水平，非洲地区显著高于全球平均水平，这可能跟种族、流行的血清型和筛查力度等相关[55]。 现有研究发现，全球孕妇携带的GBS 血清型以Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、V 型多见，分型的方法以前主要是依靠抗血清，而现在多采用PCR 方法分型。 利用抗血清法存在交叉凝集和不分型菌株，且试剂较为昂贵；现一些实验室已经使用多重PCR 分子技术将GBS 分为10 个血清型，检测时间短，准确性高，为流行病学调查提供了好的技术手段。

大部分国家孕妇携带的GBS 对青霉素类和头孢菌素类药物敏感，仅少部分地区如日本和非洲的一些城市分离到对青霉素耐药株。 仅澳大利亚孕妇携带的GBS 对红霉素和克林霉素耐药率＜10%，对于青霉素严重过敏患者可以将其作为二线药物使用。 其他地区必须依据药物敏感测试结果才能使用。

大量研究表明，大范围预防性用药[56]，可能会增加耐药菌株的产生，并且仅对预防新生儿早发型感染有一定效果，不能明显预防迟发型感染[57]。甚者会对新生儿产生一定的不利影响[58]，寻求其他预防策略势在必行，疫苗是目前最好的方法[59]。

4 总结

B 族链球菌的筛查非常有必要，然而不同筛查方法得到的GBS 阳性率有所差别。 在多种方法中，培养方法仍然为基本技术，有条件实验室使用PCR 方法更为方便、阳性率更高。 大量资料显示，目前血清型以Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、III、V 型最多见，分离的菌株对青霉素绝大地区均全敏感，说明仍可作为一线用药，而对于严重过敏患者需要根据红霉素和克林霉素药敏结果用药。 要想达到理想预防GBS 感染效果，疫苗无疑是最佳选择，已有数据[60]表明五价联合疫苗能预防96%新生儿感染和88%儿童与成人感染。 目前疫苗处于临床二、 三期阶段，相信不久未来，突破一些技术障碍就可以制备出安全有效的疫苗，使母婴减少一种病原菌的威胁。