针刺治疗脑缺血再灌注损伤相关信号通路的机制研究进展

张勇

(联勤保障部队第九四〇医院,兰州 730000)

在中医学中,脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI)的记载最早见于《内经》中,又名“卒中”“薄厥”等,属于“中风病”范畴。西医学的CIRI是指脑缺血一定时间,在梗死相关血管开通恢复血液供应后,却出现了比血管闭塞时更加严重的急性脑功能障碍。世界上每年约有 1500多万患者遭受缺血性脑血管病的折磨,中国每年约有 200多万人罹患脑血管疾病,且本病每年还在呈增多趋势发展,严重影响人们的健康[1-2]。CIRI的病理生理机制包括能量代谢紊乱、兴奋性毒性、自由基损伤、钙超载、炎性反应、细胞凋亡等[3-4]。本病治愈率极低,致残率和高死亡率极高,预后极差,越来越多的研究关注于非药物疗法,尤其是传统中医学疗法。目前有大量研究表明,针灸对于CIRI有着良好的治疗效果[5-6]。其中,针刺疗法是针灸治疗中最常应用的一种方法,该方法主要通过疏通经络、行气活血来达到调理人体机能的作用。近年来,针刺疗法在治疗CIRI方面疗效显著,因具有适应证广、操作方便、经济安全、不良反应小等优点,深受患者的欢迎。笔者通过总结近年来针刺对CIRI的最新治疗机制研究进展,以期为CIRI的中医学临床治疗提供参考,现报道如下。

1 针刺治疗与细胞因子

细胞因子是由免疫细胞受损伤后释放出的分子,包括促炎因子和抗炎因子两种。缺血性损伤导致的局部炎性反应会引起细胞因子的大量释放。促炎细胞因子主要包括肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素-6(IL-6)等,这些促炎细胞因子可诱导白细胞迁移至缺血脑组织区域,这些聚集的白细胞进一步释放更多的促炎细胞因子,加重脑组织的缺血损伤[7]。直接靶向抑制这类促炎细胞因子和促进抗炎因子的释放可有效改善和治疗CIRI[8]。针刺治疗可动态调控各类炎症因子,包括白介素(IL)、肿瘤坏死因(tumor necrosis factor, TNF)、细胞间黏附分子(inter cellular adhesion molecule, ICAM)、干扰素(interferon,IFN)等,同时减缓细胞毒性、减少细胞凋亡、保护血脑屏障。

TNF-α是一种具有致炎作用的细胞因子,可诱导机体内其他炎症信号通路的激活,使机体内的炎症进一步加重和扩散。方晨晨等[9]采用改良 Longa线栓法制备右侧大脑中动脉脑缺血大鼠模型,并于2 h后拔出线栓开始再灌注时针刺百会、大椎穴,结果显示,大鼠CIRI后脑组织中TNF-α基因及蛋白表达量较假手术组显著增加,表明机体受到缺血组织血流再通的二次损伤后,产生强烈的应激反应,快速刺激 TNF-α的大量释放表达,进一步激活体内其他炎症信号通路,从而加重体内的炎症反应,导致炎症扩散,造成恶性循环;而针刺百会、大椎穴后,针刺组TNF-α基因及蛋白表达量均较模型组显著降低,推测电针干预通过抑制脑缺血再灌注模型大鼠的促炎因子 TNF-α的分泌抑制促炎细胞在缺血区的聚集和激活,有效减缓缺血再灌注损伤的炎症反应,改善脑缺血程度,帮助缺血再灌注损伤脑组织神经功能的恢复。许军峰等[10]也使用线栓法制作大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)型脑缺血大鼠模型,缺血90 min后行再灌注时针刺内关、水沟、三阴交3个穴位,结果表明,MCAO模型组脑缺血6 h时TNF-α mRNA表达较假手术组明显降低,IFN调节因子(interferon regulation factor,IRF)-7 mRNA和IFN-β mRNA表达则较假手术组明显升高,而MCAO模型组脑缺血5 d时TNF-α mRNA表达和IRF-7 mRNA则较模型组明显降低,这种表达差异说明脑缺血再灌注后6 h和5 d时炎症因子的表达升高与否与炎症因子的启动时间密切相关。而针刺组在脑缺血 6h TNF-α mRNA表达较模型组明显升高,IRF-7 mRNA表达则明显降低,IRF-7 mRNA和IFN-β mRNA在脑缺血5d时则较模型组明显升高,说明针刺治疗不能抑制TNF-α mRNA表达,但能够抑制IRF-7 mRNA的表达和促进 IFN-β mRNA表达,从而极大地改善了CIRI模型大鼠的神经功能活动,能够减缓CIRI的程度,本实验也说明CIRI后至少5 d内不宜针刺,因为5 d内针刺具有诱发脑水肿和加重脑神经损害的风险。上述的研究结果充分说明,针刺对CIRI炎症因子的干预效果取决于很多因素,如穴位的选择、针刺治疗的时间、不同炎症因子的分泌时间等。

IL-1β在CIRI后,由浸润到局部脑组织的单核-巨噬细胞、活化的星形胶质细胞和少突胶质细胞分泌[11],对炎症反应的调节机制如下,①IL-1β促进内皮细胞表达黏附分子、募集白细胞和刺激单核-巨噬细胞产生TNF-α、IL-6等细胞因子而加重局部炎症反应;②I L-1 β能够促进基质金属蛋白酶(m a t r i x metalloproteinases, MMPs)的表达,进而破坏血脑屏障,促使缺血局部脑组织的炎症反应,通过血流活化外周免疫系统中的炎性细胞,进一步募集外周炎性细胞回流至缺血局部脑组织,加重炎症反应;Paredes SD等[12]通过建立 Wistar雄性大鼠大脑中动脉阻塞的模型,发现随着时间的延长,IL-1β会逐渐增加,加重炎性反应及细胞凋亡,而通过抑制 IL-1β能达到保护神经功能的作用。IL-6是重要的炎症介质,可导致脑炎性损伤,主要在脑缺血急性期表达急剧升高[13],其水平是反应脑缺血损伤早期的灵敏性指标。有研究[14]报道,MCAO模型中IL-6在外周2 h即开始上升,早于脑组织24 h开始上升。葛建彬等[15]采用颈总动脉栓线法和缺血 2 h后拔出栓线造成短暂性大脑中动脉阻塞(transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO)小鼠模型,结果发现,脑缺血再灌注后 24 h,CIRI模型小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平较假手术组明显升高,NF-κB p65蛋白表达也显著升高,而枸杞多糖干预后,则可以使 CIRI模型小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平明显降低,NF-κB p65蛋白表达也显著降低。这一结果说明,脑缺血可以激活NF-κB等转录因子,进一步活化缺血脑组织中的单核巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞等炎症细胞,从而大量分泌 TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β等炎性细胞因子,从而促进胞外氧自由基、细胞因子、溶酶体酶等炎症介质的大量释放进一步加重脑组织损伤,引起 CIRI[16]。陈人豪等[17]用改良Longa法制备CIRI大鼠模型后研究结果也发现,CIRI大鼠模型脑组织SOD、GSH-Px活性较假手术组显著降低,MDA、IL-6、IL-1β及TNF-α水平则较假手术组显著升高,而给予刺五加干预后,则使CIRI大鼠模型脑组织SOD、GSH-Px活性显著升高,MDA、IL-6、IL-1β及TNF-α水平显著降低。这一结果则说明CIRI中,氧化应激决定着炎性细胞因子的分泌状态,氧化应激会促进活性氧和促炎细胞因子 IL-6、IL-1β及 TNF-α的分泌,同时也会促进炎症细胞因子 IL-6、IL-1β及 TNF-α的产生,进一步加重 CIRI程度。王博等[18]采用改良的MCAO线栓法缺血2 h后行再灌注3 h复制右侧局灶性CIRI大鼠模型后进行针刺百会、肾俞、三阴交等穴位电针预处理后,结果发现针刺治疗组海马组织IL-1β、IL-6、TNF-α的含量和NF-κB的蛋白表达均较模型组显著降低,提示标本配穴电针预处理可能抑制 NF-κB表达,从而抑制 NF-κB下游炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌而减轻炎性反应,从而保护CIRI大鼠模型的神经元。陈素辉等[19]研究也发现,针刺CIRI模型大鼠的督脉百会穴、足三里穴后,在患侧缺血脑区的IL-6表达水平在12 h、24 h、48 h、72 h、96 h和144 h等时间点均显著降低。还有研究[20-21]发现,电针治疗能显著减少脑缺血/再灌注模型大鼠TNF-α和 IL-6的含量。同样,电针能同时抑制大脑中动脉闭塞再灌注区脑组织和血清中 TNF-α、IL-1β和IL-6的水平,从而改善大脑中动脉闭塞再灌注大鼠的脑梗死面积以及其运动能力[22]。抗炎因子白介素-10(IL-10)在调节先天免疫反应的负反馈途径中发挥重要作用,可抑制多种促炎细胞因子的产生[23]。王涛等[24]通过线栓法夹闭颈内、颈总动脉血管缺血2 h后拔出尼龙线复制 CIRI大鼠模型,结果发现,模型组大鼠 TNF-α、IL-1β含量明显高于假手术组,IL-10含量明显低于假手术组,七氟烷预处理则可以促使 TNF-α、IL-1β含量降低,IL-10含量升高。说明CIRI中抗炎因子的分泌减少,使其对炎症因子 TNF-α、IL-1β的调控作用减弱,从而极大地促进了促炎因子的分泌,加重了CIRI的程度,加重了其神经损伤。叶涛等[25]采用改良Longa线栓法制备脑缺血再灌注大鼠模型,结果发现,再灌注 12 h,电针预处理组血清 TNF-α含量较模型组降低,血清IL-10含量则较模型组显著增加较高;再灌注24 h,电针预处理组血清 TNF-α和IL-10含量均较模型组降低,说明电针可能通过调节脑缺血再灌注急性期外周循环血中促炎因子 TNF-α与抗炎因子 IL-10间动态平衡,从而对抗其炎性反应的加剧,缓解其神经损伤。而WANG P等[26]则发现脑缺血再灌注6 h模型鼠的血清 IL-10含量是升高的,但电针干预不能调节血清IL-10水平的下降。这一结果说明,IL-10等细胞因子的表达受到很多因素调控,比如外源性条件(实验环境、电针穴位选取、干预时间),内源性环境(CIRI的造模方法、再灌注时间、再灌注损伤程度)。Dai X等[27]研究则发现这些炎症因子还能激活机体内凋亡信号通路,使细胞发生凋亡,加重脑缺血的神经损伤。因此,针刺治疗 CIRI的机制可能是通过抑制炎症因子的表达和促进抗炎因子的表达来抑制缺血性脑组织梗死区的炎性细胞浸润和防止血脑屏障的破坏,或者是通过抑制氧化应激反应来抑制促炎因子的产生和分泌,进一步减少缺血性脑组织梗死区的炎性细胞浸润,有效减缓神经损伤,还可能是通过抑制NF-κB表达,从而抑制其下游区促炎因子的表达,进而抑制体内凋亡信号通路,有效缓解脑缺血对梗死区的神经损伤,从而发挥对缺血性脑组织神经细胞的保护效应,改善其神经功能。

2 针刺治疗与自由基

自由基,又名游离基,是机体活动代谢的中间产物,包括超氧阴离子(superoxide anion,O2﹣)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、脂质过氧化物(lipid peroxides,LPO)以及羟自由基(hydroxyl free radicals,OH﹣)等。当脑组织缺血时,机体增多的自由基和自由基清除能力的下降破坏了其氧化与抗氧化作用的动态平衡,使机体发生氧化应激损伤,这可能是导致CIRI的重要因素[28]。机体在缺血情况下,产生大量高活性分子如活性氧自由基和氮自由基,引起炎性细胞入侵,抑制超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性和促进丙二醛(malondialdehyde, MDA)等脂质过氧化物分泌增多,产生氧化中间产物,造成组织细胞损伤[29]。邰东梅等[30]在眼针(眼针取穴采用自制大鼠眼针穴区定位器进行穴区定位,标记好肝区、上焦区、下焦区和肾区)与体针(取大鼠曲池穴直刺 5 mm,足三里穴向右侧刺入1 cm)对CIRI 24 h大鼠氧自由基和细胞间黏附分子表达的差异研究中发现,CIRI模型组大鼠血清中 SOD活性明显低于正常组,MDA含量及ICAM-1蛋白和基因表达明显高于正常组,给予眼针与体针治疗后,干预组大鼠血清中 SOD活性较模型组明显升高,血清MDA含量和脑组织ICAM-1蛋白及基因表达均较模型组明显下降,眼针组与体针组之间 SOD活性、MDA含量和ICAM-1蛋白及基因表达差异均无统计学意义。这一结果说明,眼针与体针通过提高SOD的活性和抑制MDA的含量来维持CIRI模型大鼠的氧化和抗氧化之间的动态平衡,还通过抑制ICAM-1的表达抑制炎症细胞在CIRI模型大鼠脑缺血区的大量聚集,从而减轻其炎症反应和神经损伤。李丹等[31]研究也发现,标本配穴组(百会、肾俞、三阴交)和常规配穴组(百会、大椎、水沟)MDA含量均较模型组显著降低,SOD活性和GSH-Px活性均较模型组显著升高;标本配穴组MDA含量显著低于常规配穴组,SOD活性及GSH-Px活性均显著高于常规配穴组。说明“标本配穴”电针的治疗机制可能是通过提高自由基清除酶的活性来清除体内自由基的蓄积,从而减轻自由基对CIRI模型鼠神经元的氧化应激损伤,达到治疗作用。在针刺百会、四神聪对CI/RI模型大鼠抗氧化作用实验研究中[32],针刺组大鼠给予百会、四神聪穴针刺,每间隔8 h干预1次,至72 h结束,非穴区对照组大鼠分别于百会、四神聪穴区周边5 mm处进行针刺,每间隔8h进行1次,至72 h结束。结果发现,针刺组大鼠缺血半暗带组织中 SOD、GSH-Px含量和Nrf2、p-Nrf2表达水平较非穴区对照组显著升高,进一步说明针刺治疗可能是通过激活Nrf2信号通路来提高脑缺血再灌注模型大鼠缺血半暗带脑组织中的抗氧化酶活性,从而减轻其氧化应激损伤,发挥治疗作用。黄玉栋等[33]在颅针对CIRI大鼠氧化应激的影响实验中,颅针组采用 0.35 mm×13 mm毫针沿各颅骨缝头皮线成 15°角针刺,针刺后施以电针(电流0.3 mA,疏密波,疏波频率20 Hz,密波频率100 Hz),以大鼠出现头部轻度抖动为度,留针30 min,每日1次,共治疗7 d。结果发现,颅针治疗组血浆SOD活性较模型组显著升高,MDA和NO含量较模型组显著降低,进一步说明针刺治疗的作用机制是通过调节氧化应激途径实现其保护作用的。总之,针刺治疗CIRI的另一机制可能是通过提高机体的抗氧化酶活性来清除机体自由基的蓄积和抑制机体氧化产物的产生,从而维持机体氧化和抗氧化之间的动态平衡,从而减轻缺血脑组织的氧化应激损伤,或者是通过激活机体的氧化应激反应信号通路 Nrf2信号通路来提高机体的抗氧化酶活性,维持机体氧化和抗氧化之间的动态平衡,也能够减轻缺血脑组织的氧化应激损伤,进一步改善神经细胞功能,从而发挥治疗作用。

3 针刺治疗与钙离子(calcium, Ca2﹢)变化

CIRI的发生机制与Ca2﹢超载密切相关。Ca2﹢超载可触发一系列包括半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶激活、ATP合成抑制、钙依赖性蛋白酶与核酸内切酶的激活等下游反应,最终导致CIRI后神经元的损伤与死亡。相关研究显示,脑缺血时,各种原因如氧化应激损伤可以引起Ca2﹢内流增加,使细胞内Ca2﹢含量增加,引起Ca2﹢超载,导致细胞内Ca2﹢级联反应,引发缺血区脑神经元的细胞凋亡[34-35]。此外,脑缺血后造成的细胞内Ca2﹢超载,会进一步加重缺血脑组织区的细胞水肿和线粒体膜损伤,促进其缺血脑组织区氧自由基和 CaM含量增高等,胞内Ca2﹢可以与CaM结合形成复合物,后者通过促进神经递质 5-羟色胺和去甲肾上腺素的释放来引起缺血脑组织的血管发生强烈收缩,从而加重脑缺血、缺氧的程度,造成恶性循环[36]。柳四新等[37]通过对大鼠MCAO模型实验发现,Glu能够促进Ca2﹢内流,提示Glu引起CIRI模型鼠Ca2﹢超载机制是通过L-型钙通道钙内流后激活钙库释放,致Ca2﹢内流增加,最终引起缺血区的脑水肿。墙建军等[38]对缺血再灌注损伤模型小鼠取百会和大椎穴进行电针预处理,结果发现电针预处理可明显抑制大脑皮质神经细胞TRPC6与Caspase-3蛋白表达,降低细胞内 Ca2﹢浓度,抑制神经细胞凋亡。提示电针预处理可能通过下调TRPC6和减少细胞Ca2﹢内流来抑制脑缺血再灌注大鼠的神经凋亡,从而发挥对脑缺血再灌注大鼠脑损伤的保护作用。为此,针刺治疗调控CIRI的机制可能是通过抑制机体的各种氧化应激反应来减少细胞内 Ca2﹢内流,从而减轻缺血脑组织区的细胞水肿和线粒体膜损伤,延缓缺血脑组织神经细胞凋亡,发挥防治作用,或者是通过抑制Ca2﹢-CaM复合物的形成,从而抑制血管收缩剂 5-羟色胺和去甲肾上腺素的释放,缓解脑缺血缺氧,以保护脑组织。

4 针刺治疗与细胞自噬

细胞自噬是广泛存在于真核生物中的对机体生理病理中起重要作用的程序性降解机制,可通过包裹和分解损伤的生物大分子或细胞器而产生新的能量物质,供细胞循环再利用,从而维持细胞自身稳态[39]。在CIRI中,细胞自噬被认为是脑缺血后半暗带内的先于凋亡发生的第三种细胞死亡方式[40]。已有研究[41]证实,脑缺血/再灌注损伤通过激活自噬来提高CIRI的神经元存活,从而发挥保护作用。石秋艳等[42]研究也发现,局部脑缺血模型大鼠海马组织CA1区LC3-Ⅱ表达是显著增加的,说明自噬的进一步激活可以减轻CIRI程度。黄亚光等[43]对右侧大脑中动脉栓塞缺血(MCAO)大鼠模型于术前5 d开始电针刺激百会和双侧曲池、足三里等穴,结果发现电针组大鼠自噬小体较模型组显著减少,皮层缺血区 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值较模型组显著降低,p62的蛋白表达较模型组显著上调,说明电针预处理治疗 CIRI的机制可能通过抑制其过度自噬而发挥对CIRI的神经保护作用。而刘仁超等[44]在电针神庭、百会对脑缺血再灌注后认知障碍大鼠海马区自噬的影响的实验中,对左侧大脑中动脉栓塞缺血大鼠模型于手术后2 h开始电针神庭穴和百会穴,结果发现电针组神经细胞中细胞器损伤较重,自噬及凋亡发生程度较高,LC3阳性细胞显著增多及LC3蛋白表达显著升高,提示电针神庭、百会等穴位可能通过诱导脑缺血再灌注大鼠梗死灶皮质及海马部位自噬的表达来发挥保护神经细胞的作用。研究[45]发现电针水沟穴能下调Beclin1的表达,且在再灌注24 h时下调最为显著。而另一项研究[46]显示了与之相反的结果,该研究发现,在CIRI2h后,电针大鼠神庭、百会穴10 d,电针治疗组可以增加Beclin1的表达来促进自噬的发生而发挥脑保护作用。说明不同的穴位、干预方法、干预时间及 CIRI的程度决定了自噬体蛋白LC3和 Beclin1等的表达是上调还是下调,也说明再灌注损伤的不同时段中自噬的作用是不同的,由此可见针刺对自噬具有双向调控作用。因此,对CIRI机体可采取不同时间节点进行针刺治疗,通过诱导患者自身的自噬功能来发挥抗CIRI作用。

5 针刺治疗与信号通路

5.1 针刺治疗与 Janus激酶/信号传导和转录激活蛋白(Janus kinase/Signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信号通路

JAK/STAT信号转导通路是一条能够参与细胞增殖、分化、凋亡及氧化应激等多种生物学效应细胞因子信号转导途径,同时介导机体免疫失调、炎症反应以及肿瘤生成等过程[47]。有学者发现,JAK/STAT信号转导通路不仅参与神经细胞的生长发育及衰老等生理过程,也同时参与部分神经系统疾病的病理过程,特别是与脑缺血等神经系统疾病的病理过程有着密切的关系[48]。研究证明JAK/STAT信号通路中可以影响神经元、胶质细胞和血管内皮细胞等凋亡、增殖和分化的分子主要有 JAK1、STAT1、STAT3、STAT5[48-50]。

JAK2/STAT3信号通路在调控心脑血管疾病的神经细胞的凋亡过程中起着重要作用[50]。多项研究[51-53]表明,激活JAK2/STAT3信号通路对CIRI具有神经保护作用。而另有一些研究[54-55]结果则表明,在脑缺血动物模型脑组织缺血区域,p-STAT3呈高表达,向缺血再灌注损伤模型大鼠侧脑室注射JAK2特异性抑制剂AG490和 STAT3小分子干扰 RNA后会显著降低 p-JAK2和p-STAT3的表达,从而显著降低中枢神经内凋亡细胞数量,从而减轻 CIRI模型鼠的中枢神经受损程度,发挥保护作用。Zhao JB等[56]研究发现CIRI后p-JAK2、p-STAT3在缺血再灌注损伤半暗带表达明显增强,减少其表达可减轻缺血神经细胞的损伤。梁超等[57]发现,在缺血再灌注早期使用头针刺激顶颞前斜线和顶颞后斜线,可以降低p-JAK2含量以调控整合素连接激酶的表达,减轻炎性反应;中后期使用头针会增加 p-JAK2蛋白含量促进其下游 p-STAT5蛋白表达,从而改善受损脑皮质的病理形态。苏敏芝等[58]实验研究认为,电针刺激大椎穴、百会穴可下调脑缺血区 STAT3的表达,可以改善脑功能。可见,针刺治疗通过抑制 JAK/STAT信号转导通路的关键蛋白JAK2、STAT3等的表达来减轻炎性反应和抑制神经细胞的凋亡,从而减轻CIRI的神经细胞损伤,发挥治疗作用。

5.2 针刺治疗与核转录因子-E2相关因子 2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)信号通路

Nrf2/ARE信号通路是细胞抵抗各种环境应激和内源性应激防御机制中细胞抗氧化应激反应的重要信号调控通路[59]。当细胞质内谷胱甘肽(glutathione,GSH)活性降低,O2﹣浓度升高时,会使细胞质内生理状态下耦合在一起的 Nrf2与 Kelch样 ECH联合蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1, Keap1)发生解偶联,游离的Nrf2发生磷酸化,并移位转入核内,与细胞核内部的ARE元件发生结合,ARE与Nrf2在体内相互作用,Nrf2通过调控ARE活化下游血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1, HO-1)和醌氧化还原酶1[NAD(P) H: quinone oxidoreductase 1, NQO1]等Ⅱ相抗氧化酶抗氧化物质的表达,同时产生大量抗氧化酶,发挥抗氧化作用。在Nrf2/ARE通路中,Nrf2的解偶联和磷酸化为该信号转导通路活化的关键标志。因此,Nrf2/ARE通路所发挥的调控作用成为了抗氧化药物的关键作用靶点。大量研究[60-61]发现,Nrf2/ARE通路在抗脑缺血缺氧氧化应激损伤中发挥着重要作用。赵秋阳等[62]研究发现,针刺CIRI模型大鼠的百会、四神聪穴后,其缺血半暗带组织中SOD和GSH活性显著升高,而Nrf2和p-Nrf2蛋白表达水平也显著升高。杜韬等[63]研究也发现,对脑梗死患者采取眼针八区8穴治疗(以上焦区穴及下焦区穴作为主穴,以肾区穴、肝区穴作为配穴),治疗2周后,结果发现,眼针治疗组患者的NQO1、ARE和Nrf2蛋白的表达水平显著提高,Keap1蛋白的表达水平明显降低。提示针刺干预可通过激活Nrf2/ARE通路中的关键蛋白(Nrf2、ARE、SOD和GSH蛋白)的表达发挥抗氧化应激损伤的作用,对CIRI模型大鼠的神经组织起到保护作用。

5.3 针刺治疗与Ca2﹢/钙调蛋白(calmodulin, CaM)/钙调蛋白激酶Ⅱ(calmodulin kinase Ⅱ, CaMKⅡ)信号通路

Ca2﹢/CaM/CaMKⅡ信号通路是一条体内以 Ca2﹢变化来进行调控的信号通路。当体内各种原因(如自由基O2﹣和 OH﹣的生成增多,谷氨酸和 NO的浓度升高)诱发Ca2﹢超载时,高浓度的 Ca2﹢与 CaM结合,激活了下游钙相关蛋白酶 CaMKⅡ,启动细胞死亡信号通路[64]。因此,CaMKⅡ及其底物变化参与缺血性神经损伤。抑制CaMKⅡ过度激活对缺血早期神经细胞有保护作用[65],但过度抑制反而加重细胞损伤[66],这提示神经细胞功能保护需要一定量 CaMKⅡ的活性维持。已有研究[67-68]表明,电针能调节脑缺血大鼠脑组织CaM及Ca2﹢浓度。但是针刺治疗对CIRI机体CaMKⅡ的表达是否具有调控作用,至今未见报道。为此,针刺治疗对 CIRI Ca2﹢超载的调控作用是否通过 Ca2﹢/CaM/CaMKⅡ信号通路实现,还有待研究。

5.4 针刺治疗与腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/UNC51样自噬激活激酶 1(UNC51-like autophagy activating kinase 1, ULK1)信号通路

AMPK是调控自噬起始阶段的关键蛋白。CIRI会引发脑细胞的缺血、缺氧,进一步引起脑细胞内ATP含量明显下降,导致AMP/ATP比例增高,从而激活AMPK信号通路,活化的AMPK通过激活TSC1/2复合物形成进而抑制mTOR的活性,失活的mTOR进一步抑制其下游ULK1的磷酸化,从而促进自噬的发生[69]。AMPK还可以通过直接磷酸化Raptor蛋白来抑制mTOR的活性,促进自噬的发生[70]。有研究[71]发现,对双侧颈总动脉阻闭模型小鼠在手术前给予针刺百会穴的干预,结果发现针刺预处理可以促进CIRI模型小鼠AMPK α蛋白的表达,进而通过抑制 CIRI模型小鼠脑组织缺血区的细胞凋亡来缓解CIRI的神经损伤。Liu W等[72]的研究进一步发现,对CIRI鼠再灌注24 h时采用电针刺激曲池、足三里穴,能促进 CIRI小鼠 mTOR的蛋白表达,抑制其 ULK1及Beclin1的蛋白表达。上述结果说明,针刺预处理或者直接干预,能够通过激活CIRI小鼠AMPK/mTOR/ULK1信号通路,从而抑制自噬蛋白Beclin1的表达,进而抑制 CIRI小鼠脑细胞的自噬反应改善其神经运动功能障碍,发挥脑保护效应。

6 讨论

脑卒中是导致人类致残和致死的主要疾病之一,其中约 87%为缺血性脑卒中。近年随着人民生活方式转变和人口老龄化加剧,缺血性脑卒中的发病率逐年升高并呈年轻化趋势。重建血流或增强缺血区血流供应是修复缺血性脑组织损伤的关键。但血流再灌注后脑组织损伤却进一步加重,其病理机制包括炎性反应、自由基损伤、钙超载等,当前无较好的治疗方法。因此,如何有效减轻CIRI已成为缺血性脑卒中治疗的关键。

针刺作为一种有效的治疗手段,在临床中发挥着重要的作用,对于其疗效以及机理的研究和探讨具有非常重要的意义。本研究通过总结发现,针刺对于CIRI具有良好的治疗效果,其可能机制是通过抑制JAK/STAT信号通路中的关键蛋白JAK2、STAT3等的表达来减轻炎性反应和抑制神经细胞的凋亡,从而减轻CIRI的神经细胞损伤,发挥治疗作用;还可能是通过激活 Nrf2/ARE信号通路中的关键蛋白 HO-1和 NQO1来发挥抗氧化作用,减轻CIRI神经细胞的氧化应激损伤,促进神经功能的恢复;也可能是通过降低机体的Ca2﹢与CaM的含量来减缓CIRI的Ca2﹢超载,进一步减轻氧化应激损伤,发挥治疗作用;还可能是通过激活AMPK/mTOR/ULK1来促进mTOR和抑制ULK1的表达,最终抑制自噬蛋白Beclin1和LC3的表达进而抑制CIRI鼠脑细胞的自噬反应来改善其神经运动功能障碍,发挥脑保护效应。但是,针刺治疗对CIRI Ca2﹢超载的调控作用是否通过Ca2﹢/CaM/CaMKⅡ信号通路实现,还有待深入研究。