全外显子组测序对先天性泌尿系统发育异常胎儿的致病性检出率分析

广东省东莞市妇幼保健院（523000）罗建华 徐婉芳 袁海明

CAKUT是临床一种常见的多样性先天缺陷疾病，其发生与胚胎期肾脏发育缺陷存在相关性。CAKUT在活产儿中较为罕见，但在先天性结构畸形中发生率较高，约为20%～30%，部分患儿可合并其他系统异常病变，对新生儿、胎儿存活与预后造成严重影响。早期及时发现、诊断CAKUT发生，对改善新生儿结局等意义重大[1]。WES是一种新型现代基因诊断技术，通过对疾病相关基因进行诊断，判断其致病性[2]。本研究，通过对2019年1月～2020年3月我院收治的100例超声提示CAKUT病例应用WES技术检查，分析其对致病性检出率，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入我院2019年1月～2020年3月收治的超前超声提示100例CAKUT病例，所有胎儿经染色体微阵列分析（CMA）未见异常；根据是否合并其他系统异常分组，A组74例单纯CAKUT病例，孕妇年龄18～32岁，平均年龄（24.5±6.2）岁；B组26例CAKUT合并其他系统异常，孕妇年龄19～30岁，平均年龄（25.1±6.5）岁。两组资料比较无明显差异（P＞0.05）。纳入标准：纳入对象无肾脏异常家族史，夫妻非近亲结婚，所有家属对研究知情，同意参与。

1.2 方法 外显子组测序：将50μL TE与1μg样本DNA混合，将DNA采用Bioruptor超声破碎仪片段化至200～250bp；末端补平、3'端腺苷化、接头连接、片段选择、扩增过程等依次采用Illumina FC-121-2033 DNA文库构建试剂盒进行构建DNA文库。目标区域捕获采用Hybridization Wash Kit试剂盒、NimbleGen捕获磁珠进行，再对目标区域采用瑞士罗氏公司高保真DNA聚合酶进行PCR扩增（浓度≥10nmol/L），PE100测序采用Hiseq 2500高通量模式进行。

1.3 Sanger测序验证 对可能致病性、含有致病性突变位点的胎儿、父母采用Sanger测序方法进行验证。

1.4 数据处理 突变剪切危害性预测与蛋白功能影响、注释功能的预测根据ACMG指南进行，最后将判定所有突变位点，可分为以下几类：良性、可能良性、不明确、可能致病性、致病性。

2 结果

2.1 分析WES检测结果 本研究对100例超声提示CAKUT病例进行WES检测，结果显示，检测出致病性突变病例15例，涉及基因为BBS2、HNF1B、NEK8、UMOD；可能致病性突变7例，涉及基因GRIN2B、HSPD1。在CAKUT病例中，WES的阳性检出率为22.00%（22/100）；本组22例阳性样本中，CAKUT合并其他系统异常检出率为57.69%（15/26），单纯CAKUT病例中阳性检出率为9.46%（7/74）。

2.2 分析两组WES检测结果 研究显示，在A组74例CAKUT病例中，WES检测阳性率为20.27%（15/74），其中3例病例显性遗传基因中存1个可能致病性突变，另7例含有致病性突变；WES周转时间11～12周，WES分析显示，26例胎儿结果可在孕周35+4～39+2周完成。

B组26例病例中，核心家系WES检测阳性率为26.92%（7/26），其中存在可能致病性突变3例，存在致病性突变2例，未检测出有临床意义突变13例；WES周转时间8～9周，本组2例得到致病性结果夫妇均选择终止妊娠。

B组实施核心家系检查，WES阳性率高于A组，提示核心家系检查可提高胎儿阳性率，但两组统计学对比，没有统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

目前，临床关于CAKUT致病基因方面的报道较少，有研究指出，CAKUT形成可因单个基因缺陷引起病变。临床中，最早发现CAKUT的致病基因是HNF1B、PAX2两个基因。近年来，随着医疗技术的进步，基因检测不断有新发现。临床产前检查中若超声提示CAKUT的胎儿，需要进一步检查，询问夫妇是否存在孕产史及家族史，判断胎儿是否出现染色体异常。本研究显示，对100例超声提示CAKUT病例进行WES检测，结果显示，在CAKUT病例中，WES的阳性检出率为22.00%，提示单基因变异在CAKUT发生中起到重要作用，其致病性突变基因包括：BBS2、HNF1B、NEK8、UMOD，作为已知致病基因与肾脏发育存在明显关系。GRIN2B、HSPD1基因与MRD6/EIEE27与SPG13基因相关，包含可能致病性突变。本研究显示，22例阳性检出患者中，单纯CAKUT病例中阳性检出率为9.46%（7/74），合并其他系统异常检出为57.69%（15/26），说明相比于单纯CAKUT，合并其他系统异常更容易发生基因突变。对此，本研究受到研究样本数限制，可能存在一定误差，需要大样本进一步作为研究支持。

本研究产前超声提示回声增强、双侧肾脏增大2例胎儿中，检测出基因杂合突变，突变基因为HNF1B基因c.192-191 insGTAT突变，另3例产前超声提示左侧脑室增宽双侧肾脏回声增强、肾脏增大的胎儿病例中，经过WES检查显示，基因型中存在BBS2基因复合杂合突变，突变基因为BBS2的c.1015G＞A与c.823G＞A突变。本研究显示，这5例基因突变患儿与RCDS/肾脏回声增强、BBS2存在相关性。但由于本研究纳入对象较少，研究结果存在一定误差，无法确定孤立性肾脏回声增强但GMA与核型结果正常的胎儿是否需要接受WES进一步进行诊断，因为即便胎儿产前超声显示肾脏回声增强，但并不能作为判定胎儿产后肾脏发育异常的特异性指标，仍有部分患儿产后并未出现异常情况[3]。对此，临床同样需要高度重视，产前胎儿肾脏回声异常也是提示肾脏综合性疾病、明显畸形病变的重要指标，因此。临床在超声诊断时需辅助其他手段进一步确诊[4]。

WES作为一种诊断测序的重要手段，测序的孕周选择尤为重要。本研究对A组孕妇WES周转时间11～12周，WES分析显示，26例胎儿结果可在孕周35+4～39+2周完成；B组26例病例中，WES周转时间8～9周，本组2例得到致病性结果的夫妇均选择终止妊娠。目前，临床中对于WES周转时间一般为8～15周；据有关统计显示，大部分孕妇希望周转时间＜3周[5]。因此，在产前诊断中，WES需要加快分析与检测速度，以提高其优越性。在对孕妇胎儿进行WES测序时，对胎儿父母外周血样本进行收集、检验，有利于提高WES致病性检出率准确性。本研究显示，A组WES检测阳性率为20.27%，B组核心家系WES检测阳性率为26.92%，说明对胎儿核心家系进行分析，能够提高胎儿的阳性检出率。

综上所述，产前超声提示CAKUT胎儿通过WES测序诊断，能有效提高致病性检出率。