柳叶蜡梅挥发油提取及β-环糊精包合工艺的优化

张娜娜，刘忠达，徐文峥，朱建丽，袁宙新

(丽水市中医院·浙江 丽水 323000)

柳叶蜡梅(Chimonanthus salicifolius S.Y.Hu)为蜡梅属植物，又名食凉茶、黄金茶等，比较适宜在深山区生长，主要分布在我国浙江、江西、湖南、江苏等地[1]，在畲族民间应用比较普遍。有研究表明柳叶蜡梅具有抑菌抗炎、清热解毒、镇痛、镇咳祛痰等功效[2-3]，其主要成分为挥发油[4-5]，但挥发油在使用过程中存在对空气和温度敏感、容易氧化、存储和制剂过程中容易挥散等缺点。为提高柳叶蜡梅挥发油制剂的稳定性，本文通过水蒸气蒸馏法提取挥发油，然后用β-环糊精对提取出的挥发油进行包合，采用正交试验法优化挥发油提取及β-环糊精包合工艺，用指纹图谱法验证包合物的形成，以期为提高柳叶蜡梅挥发油稳定性、促进柳叶蜡梅的利用提供技术支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器 BS 124S电子天平：Sartorius；6890N型气相色谱仪，配有FID检测器：Agilent；JB-50D型电动搅拌器：上海标本模型厂。

1.2 试药 柳叶蜡梅(产地莲都)：购自杭州桐君堂医药药材有限公司，经本院中药房鉴定为腊梅科属植物柳叶腊梅的叶。β-环糊精：购自广东郁南县环糊精厂，纯度大于98%；环己酮、正己烷、乙腈均为色谱纯，水为重蒸馏水(自制)，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 挥发油提取工艺

2.1.1 挥发油含量测定 分别取柳叶蜡梅叶400 g，各加6 倍量水。采用直接蒸馏法提取，读取不同提取时间所得挥发油毫升数。结果显示提取4 h，挥发油含量最高。见表1。

表1 不同提取时间挥发油得量

2.1.2 提取工艺优化 根据上述试验，结合查阅文献，选取药材粒度(A)、提取时间(B)、溶媒用量(C)作为考察因素，选择挥发油量为评价指标，按照L9(34)正交表进行试验，因素水平及试验结果见表2～表4。

表2 挥发油提取工艺因素水平

表3 挥发油提取工艺试验设计及结果

表4 提取工艺方差分析

表4的方差分析结果显示，因素A和B对柳叶蜡梅挥发油的提取影响具显著性，因素C无显著性影响。表4直观分析结果表明， 柳叶蜡梅挥发油最佳提取工艺应为A3B2C1，即药材粗粉，加6倍水，提取4 h。但考虑到粗粉蒸馏过程易增泡沫，并伴随水蒸汽进入挥发油中，故选工艺A2B2C1，即药材碎叶片，加6倍量水，提取4 h。

2.1.3 挥发油提取工艺验证 称取柳叶蜡梅(碎叶片)3份，按照2.1.2项下优选工艺进行验证试验，测得挥发油收率分别为2.0%(mL/g)、2.3%(mL/g)、2.2%(mL/g)，试验结果显示该提取工艺稳定可行。

2.2 β-环糊精包合工艺

2.2.1 包合试验方法 精密称取适量β-环糊精加入于三口烧瓶中，加入适量蒸馏水，加热溶解，缓缓冷却至60 ℃，制成饱和溶液，恒定温度。在400 r/min下滴加挥发油醇液，搅拌2 h，置冰箱冷藏24 h，滤过，以少量乙醇洗涤4 次，低温干燥，粉碎，过80目筛，即得疏松状白色包合物粉末。

2.2.2 包合物实际含油量测定 精密称取β-环糊精包合物干燥粉末适量，加水，按照挥发油含量测定法(中国药典2015年版四部2204 挥发油测定法)[7]，测定β-环糊精包合物实际含油量。

2.2.3 包合工艺优化 预试验发现，影响包合的主要因素为β-环糊精与挥发油的比例(A)，反应温度(B)、搅拌时间(C)。选取此三个影响因素为考察因素，选择包合物含油率[包合物中实际含油量/包合物实际重量×100%]、包合物油利用率[包合物中实际含油量/(投油量×空白回收率)×100%]为考察指标，按照L9(34)正交表进行试验，因素水平及试验结果见表5～表8。

表5 包合工艺因素水平

表6 包合工艺正交试验结果

表7 以包合物含油率为指标进行方差分析

表8 以油利用率为指标进行方差分析

表7和表8的方差分析结果显示，因素A和B对挥发油包合率的影响比较显著，因素C对试验结果影响较小。从方差分析结果来看，以包合物含油率为指标，最佳工艺为：A2B2C2；以油利用率为指标，最佳工艺为：A3B2C3。但在在实际生产中为缩短生产周期，降低生产成本，一般选择包合工艺A2B2C2，即β-环糊精与挥发油的比例为8∶1(g∶mL)，包合温度60 ℃，搅拌时间2 h。

2.2.4 包合工艺验证 按照2.2.3项下优选的最佳工艺制备3批柳叶蜡梅β-环糊精包合物，3批试验得到包合物干粉分别为14.08、14.12、14.04 g，平均得粉为14.08 g；馏出油量分别为1.45、1.50、1.42 mL，平均得油量1.46 mL，计算平均含油率为10.36%，包合率为73.0%。

2.3 包合物指纹图谱表征

2.3.1 供试品溶液的制备 称取柳叶蜡梅β-环糊精包合物20 g，按照药典附录XD-1挥发油测定；通过水蒸气蒸馏法收集挥发油，脱水，取挥发油18 mg，精密称定，用正己烷溶解定容至10 mL，摇匀，作为供试品溶液。

2.3.2 对照品的制备 精密称取柳叶蜡梅挥发油18 mg，置10 mL 容量瓶中，用正己烷定容至刻度，作为对照品溶液。

2.3.3 测定方法及结果 色谱柱INNOWAX(0.32 mm×30 m×0.5 μm)弹性石英毛细管柱；柱温70 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升温至95 ℃，12 ℃/min升温至157 ℃，2 ℃/min升温至225 ℃，保持7 min；进样口温度250 ℃；检测器温度为280 ℃，分流比为1:40；理论板数按桉油素峰计算不应低于10 000。分别精密量取供试品溶液、对照品溶液各0.2 μL，注入气相色谱仪，记录各个峰的保留时间和积分面积，结果见图1～图2。

图1 柳叶蜡梅挥发油指纹图谱

图2 柳叶蜡梅β-环糊精包合物指纹图谱

2.3.4 测定结果分析 从相对保留时间来看，柳叶蜡梅β-环糊精包合物色谱峰的6个共有峰包含在柳叶蜡梅挥发油的7个峰中，1(0.5129)，2(0.6933)，3(0.8190)，4(0.9489)，5(s)(1.0000)，6(2.1532)。

从相对峰面积比值来看，柳叶蜡梅β-环糊精包合物的1号峰(0.5129)，其平均峰面积比值(0.0794)在柳叶蜡梅1号峰(0.5128)峰面积比值(0.0774～0.1438)之间。因柳叶蜡梅β-环糊精包合物是以柳叶蜡梅和β-CD包合而成，其1号峰峰面积比值应反映柳叶蜡梅的1号峰峰面积比值。结果表明柳叶蜡梅指纹图谱与其β-环糊精包合物指纹图谱非常相近，符合原料油与制剂之间指纹谱相近性的要求。

从共有峰的个数来看，柳叶蜡梅β-环糊精包合物有6个共有峰，柳叶蜡梅有7个共有峰。出现这种情况，可能由于制剂中的挥发油经包合、样品蒸馏提取两个过程的处理，导致包合物样品的指纹图谱中的第7个峰的不稳定性，也可能第7个峰的物质与β-CD结合非常牢固，不容易被水蒸气蒸馏出来之故。因此柳叶蜡梅β-环糊精包合物只有6个共有峰。

3 讨论

本实验对整叶片、碎叶片、粗粉 3种不同粒度的柳叶蜡梅进行挥发油提取，发现研磨成粗粉，挥发油提取量较大，但是粗粉在蒸馏过程易增泡沫，并伴随水蒸汽进入挥发油中；对挥发油提取时间进行了考察，发现4 h提取量>5 h提取量>3 h提取量，可能是因为提取时间过短，挥发油还未提取完全；若提取时间过长，会导致挥发油的挥发和氧化损失，因此本试验确定最佳提取工艺为柳叶蜡梅碎叶片、加入6倍量水，提取4 h。实验中发现，在挥发油提取器中加入一定量正己烷来收集挥发油，等正己烷彻底挥干后再进行精密称定，可以解决挥发油微量挥发导致读数不准的缺陷。

在包合物制备过程中发现，以包合物含油率、油利用率进行分别分析，均显示60 ℃的包合物收率高于40 ℃、80 ℃的收率，表明随着包合温度的升高、包合反应速度的加快，生成的包合物量也越大；但温度过高时，会导致部分挥发油挥发，减少包合物生成量；温度过低时，导致β-环糊精溶解度下降，亦会减少包合物生成量。对β-环糊精与挥发油的比例、搅拌时间考察发现，包合物的生成量与β-环糊精与挥发油的比例、搅拌时间呈正相关；但为缩短周期、节约成本，本试验选择β-环糊精与挥发油的比例8∶1(g∶mL)，包合温度60 ℃，搅拌时间为2 h为最佳工艺。

指纹图谱表征显示柳叶腊梅与β-环糊精包合已经形成，包合状态良好；同时对提取工艺、包合工艺进行验证发现，该工艺操作方便、稳定可行，对提高柳叶蜡梅中挥发油的稳定性，促进柳叶蜡梅的使用利用有着积极意义。