水蛭对局灶节段性肾小球硬化大鼠肾脏MMP-9、TIMP-1蛋白表达的影响

杨 馨,刘 娜,张佩青,王海艳,陈 明

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

水蛭是有破血、逐瘀、消癥功效的一味虫类药，其主要成分为蛋白质及多肽分子，按药理分为直接作用于凝血系统的活性成分、其他蛋白酶抑制剂组分，以及一些小分子化合物和微量元素[1]。水蛭制剂在肾脏疾病的治疗中已经得到广泛应用[2]，在前期的实验研究中，本课题组发现水蛭能够保护FSGS大鼠肾脏，减轻肾脏病理形态学改变，减少细胞外基质(ECM)的重要组成部分Ⅳ型胶原蛋白和纤维粘连蛋白的表达，使局灶节段性肾小球硬化的进程得到延缓[3]。基质金属蛋白酶类是调控ECM降解的重要酶类，参与ECM的重塑并稳定组织的发育和内环境，其中MMP-9主要降解Ⅳ型胶原蛋白，TIMP-1是MMP-9的特异性抑制因子，MMP-9与TIMP-1的动态平衡在ECM的生理平衡中起关键作用[4-5]。本实验观察水蛭对FSGS大鼠肾脏MMP-9、TIMP-1蛋白表达的影响，进一步探讨其延缓局灶节段性肾小球硬化进程的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年雄性SPF级Wistar大鼠52只，180～220 g，实验动物许可证号：SCXK-(吉)2011-0003；由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。

1.2 主要药品与试剂 水蛭江阴颗粒(0.5 g/袋：相当于饮片3 g)：江阴天江药业有限公司。阿霉素：辉瑞制药(无锡)有限公司；兔抗大鼠MMP-9多克隆抗体、兔抗大鼠TIMP-1多克隆抗体：北京博奥森生物技术有限公司；PV-6001兔抗鼠二抗：北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 主要仪器 2135型切片机：德国莱卡；CK-2型光学显微镜：CH型摄影显微镜：日本OLYMPUS；美国moticam3000显微摄影成像系统。

1.4 模型制备、分组 实验大鼠购入后适应性喂养1周后，随机分为正常组12只，假手术组12只，造模组28只。造模组行左肾切除术，术后大鼠无死亡，术后第7天经尾静脉注射阿霉素4 mg/kg，7 d后再将造模组大鼠随机平均分为模型组(14只)与水蛭组(14只)。模型组与水蛭组于术后第35天经尾静脉再次注射阿霉素3 mg/kg。假手术组仅剥离肾脏脂肪包膜，并予等量的生理盐水于相同时间点尾静脉注射。正常组不作处理。

1.5 给药 术后第14天，水蛭组采用水蛭0.9 g/(kg·d)灌胃；假手术组、模型组予等体积容量蒸馏水灌胃。共治疗8周。

1.6 肾组织MMP-9、TIMP-1蛋白表达检测 采用免疫组化PV6001二步法。分别于给药后第4周末，第8周末测定肾组织MMP-9、TIMP-1蛋白的表达。于400倍下以moticam3000显微摄影成像系统摄片，以积分光密度(IOD)代表蛋白相对表达量，采用Image-pro plus6.0病理图像分析系统对阳性表达进行定量分析，IOD=阳性面积×平均光密度。

2 结果

2.1 各组大鼠肾组织MMP-9 表达的检测结果 第4、8周正常组与假手术组MMP-9在肾小球脏层上皮细胞、肾小管上皮细胞有少量表达，与正常组、假手术组比较，模型组和水蛭组MMP-9表达增多(P<0.01)。第4、8周水蛭组与模型组比较，MMP-9表达增强(P<0.01)。见图1，表1。

图1 各组大鼠4、8 周肾组织MMP-9免疫组化检测结果(×400)

表1 各组大鼠4、8 周肾组织MMP-9表达光密度的比较

2.2 各组大鼠肾组织TIMP-1表达的检测结果 第4、8周正常组与假手术组TIMP-1在肾小球上皮、内皮、系膜、肾小管上皮细胞及肾间质有表达，与正常组、假手术组比较，模型组和水蛭组TIMP-1表达增多(P<0.01，P<0.05)。第4、8周水蛭组与模型组比较，TIMP-1表达减少(P<0.01)。见图2，表2。

图2 各组大鼠4、8 周肾组织TIMP-1免疫组化检测结果(×400)

表2 各组大鼠4、8周肾组织TIMP-1表达光密度的比较

3 讨论

FSGS是原发肾病综合征的一种病理类型，在我国发病率呈现上升趋势，有调查显示2005至2009年东北地区FSGS占原发性肾小球疾病的比例为4%[6]，华中地区FSGS所占成人原发肾病综合征比例由从2009至2010年的5.8%增加到2011至2012年的14.7%[7]。治疗上以激素和免疫抑制剂为主，但这些药物的毒副作用不可忽视，中医药在减少蛋白尿及延缓肾小球硬化和肾间质纤维化方面，以及减少激素、免疫抑制剂副作用方面有独特优势。目前研究认为，肾小球ECM的过度积聚是 FSGS 的重要病理改变[8]，ECM产生的主要来源是肾小球内皮细胞、系膜细胞和上皮细胞，当肾小球受到创伤时，其内存在的使ECM降解的酶类则合成增加来促进ECM降解[9-10]。阿霉素致局灶节段性肾小球硬化模型可以较好的模拟FSGS的病变过程[11]。根据本实验结果，笔者认为造模后随着病变的逐渐进展，ECM合成增多，MMP-9为降解ECM，其表达开始逐渐增强，同时诱导TIMP-1表达相应也增强，随着时间延长，给药8周末各造模组MMP-9表达有所减弱、但TIMP-1表达仍呈逐渐增强的趋势，说明MMP-9出现表达减弱，可能是由于TIMP-1表达持续增多，MMP-9被逐渐消耗所致，其对ECM的降解作用减弱，故ECM增多，导致FSGS的发生。水蛭可以通过上调MMP-9、降低TIMP-1蛋白的表达，从而加强对ECM的降解，减轻ECM积聚；提示水蛭对ECM的主要降解酶系之一的基质金属蛋白酶系统具有调控作用，可能是其干预FSGS进展的作用机制之一。