森登-4味汤对膝骨性关节炎家兔关节软骨组织MMP-1、TIMP-1表达的影响

赵巴根那，乌云高娃，金 刚，那 坤

(1内蒙古民族大学附属医院·内蒙古 通辽 028000；2北京小汤山医院·北京 102211)

膝骨性关节炎主要通过降解软骨，侵犯关节滑膜造成机体损伤[1]。其临床表现为膝关节部位肿痛、畸形和活动被限制，后期多数伴有关节腔隙变窄、关节边沿及骨刺形成，可造成关节僵硬，严重影响患者身心健康。随着人口老龄化社会进展，骨性关节炎的患者不断增加，而膝关节是骨性关节炎发病最常见的部位[2]，因此国内外对于膝骨性关节炎的防治研究十分重视。蒙医药在防治膝骨性关节炎方面有着悠久的历史和良好的疗效，具有较好的研究前景[3]。森登-4味汤在临床使用多年，对膝关节骨性关节炎有良好的疗效，有多项研究指出蒙药森登-4味汤能缓解骨性关节炎的炎症状况，但其治疗作用及作用机制尚待进一步研究。本实验观察了蒙药森登-4味汤对膝骨性关节炎家兔膝关节关节面变化及软骨组织MMP-1(基质金属蛋白酶-1)、TIMP-1(基质金属蛋白酶抑制物-1)蛋白表达的影响，探讨蒙药森登-4味汤对膝骨性关节炎的治疗作用及作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 成年家兔80只，清洁级，雌雄不限，体质量2.0～2.5 kg，由长春亿斯实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号: SCXK(吉) 2016-001。实验动物保持合理的明暗周期，明期6：30-18：30，适应性喂养1 周。

1.2 药物 森登-4味汤：由文冠木、诃子、栀子、川楝子等药味组成，内蒙古民族大学附属医院蒙药药房供应。

1.3 试剂和仪器 MMP-1—抗兔多克隆抗体、TIMP-1—抗兔多克隆抗体、羊抗兔IgG：武汉博士德生物科技责任公司；Western blot技术所需的设备与材料由内蒙古民族大学蒙医药学院提供。AUY-120电子天平(max 201g d=0.01mg)：日本岛津公司；Gel Doc 2000凝胶成像系统；SDS-PAGE凝胶电泳仪。

2 方法

2.1 模型制备与分组处理 80只成年家兔适应性喂养1 周后，随机选出64只采用改良Hulth法[4]进行造模。实验兔编号，用30 g/L戊巴比妥钠于耳缘静脉注射进行麻醉(30 mg/kg)，将兔双膝伸直位固定于手术台，常规剃毛、消毒、铺巾；在家兔右后肢膝关节内侧纵向切口长约2.0～2.5 cm，切断内侧副韧带及完整摘除内侧半月板；随后止血、缝合，常规包扎。手术过程中应谨慎注意不损伤关节软骨面，术后每只家兔注射青霉素40万U/d连续7 d，以预防术后引起的感染[5]。随后进行每天3次驱赶，每次驱赶时间至少30 min，4周后造模成功。将造模成功的64只家兔随机分为4组： 模型组(16只)、森登-4味汤高剂量组(16只)、森登-4味汤中剂量组(16只)、森登-4味汤低剂量组组(16只)，另取16只正常家兔作为正常对照组。森登-4味汤高剂量组灌胃剂量为 45 mg/(kg·d);森登-4味汤中剂量组灌胃剂量为 30 mg/(kg·d)；森登-4味汤低剂量组灌胃剂量为 15 mg/(kg·d)；模型组等量蒸馏水灌胃，正常对照组则照常饲养，不作任何处理，给药时间为4周。

2.2 观察指标及检测方法 末次灌胃结束后，立刻将全部家兔处死，无菌手术下打开膝关节，进行相关指标检测。

2.2.1 关节面大体观察 每组各取6只大体观测膝关节关节面的变化，按以下标准评分[5]。关节面平整 ：0分；关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗：1分；关节面光滑度差，软骨欠缺深度到达一半：2分；关节发生溃烂，软骨缺损变极少：3分；软骨剥脱，软骨下骨质外露：4分。

2.2.2 Western blot检测兔膝关节软骨组织MMP-1和TIMP-1蛋白表达 取股骨远端及胫骨近端部分软骨组织在冰面上低温状态下制作匀浆、离心，编号放入塑料离心管内，封闭，-80 ℃冷冻。细胞裂解法提取兔膝关节软骨组织总蛋白，Bradford法测定蛋白含量后，制作凝胶点样本，用电泳仪转移蛋白到浓缩胶上，用转移电泳槽转印到PVDF膜上，孵一抗2 h、孵二抗室温过夜，加入A、B显色酶显色。最后用Gel Doc 2000凝胶成像系统进行成像。

3 结果

3.1 各组家兔关节面大体观察结果 正常组动物关节面平整，光滑度较好；模型组关节软骨主要出现溃烂、软骨剥脱、软骨下骨质外露。蒙药森登-4味汤低剂量组、中剂量组和高剂量组膝关节大体评分明显低于模型组，有显著性差异(P<0.05)。见表1。

表1 各组家兔膝关节关节面评分比较分)

3.2 各组家兔膝关节软骨组织MMP-1、TIMP-1蛋白表达的Western blot检测结果 见表2。

表2 各组家兔膝关节软骨组织MMP-1、TIMP-1蛋白表达检测结果比较

模型组与正常组比较，模型组MMP-1、TIMP-1蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，森登-4味汤各剂量组MMP-1明显下调，TIMP-1蛋白表达均明显增加，中剂量组和高剂量组明显优于低剂量组(P<0.05)；中剂量组与高剂量组比较无明显差异(P>0.05)。

4 讨论

膝骨性关节炎(KOA)是伴有机械异常的常见关节疾病，关节软骨降解是KOA的重要病理标志[7]。膝骨性关节炎尽管病因繁多，但往往都是因为干扰软骨细胞和细胞外基质造成软骨细胞受损、使软骨基质降解超标而发病[8]。关节软骨细胞基质的生成与分解失衡是 KOA软骨退变的罪魁祸首。当下，多项研究表明 MMPs可能在其中起不可忽视的作用。MMPs 除能降解多糖以外，还能降解所有细胞外基质成分[9]。TIMPs 是MMPs的特异的抑制剂，广泛存在广泛结缔组织中，可抑制所有胶原酶的活性。正常情况下，TIMPs可与 MMPs形成不可逆的1∶1非共价键结合，维持着软骨细胞外基质合成与降解的相对平衡 ，MMPs的异常增高，或者MMPs与TIMPs两者之间的动态平衡的失调，已成为研究KOA发病机制的重要靶点[10]。蒙药森登-4味汤由文冠木、诃子、栀子、川楝子等药味组成，有着清热燥黄水的功能，主治痛风、痹病、关节黄水病、关节水肿等。在临床上广泛用于治疗关节炎及水肿等病症。近年来有关森登-4味汤研究较多，国内许多研究表明具有显著的抗炎作用[11]，但具体抗炎机制尚未明确。本研究中发现TIMP-1、MMP-1在膝关节骨性关节炎模型组动物关节软骨组织中有异常升高的现象。森登-4味汤灌胃治疗后动物关节软骨组织中 MMP-1、蛋白表达明显低于模型组,TIMP-1表达高于模型组。推断TIMP-1、MMP-1蛋白的异常表达或者TIMP-1、MMP-1二者之间的失衡是膝关节骨性关节炎发病机制之一。蒙药森登-4味汤可能是通过抑制和调节TIMP-1、MMP-1的表达保护关节起到治疗作用。