中医手法治疗膝关节骨性关节炎的临床疗效观察及其对NF-κB信号通路的影响

孙松涛，钟 声，许 辉，解 骏，高晨鑫，翟伟韬，肖涟波

(1上海中医药大学·上海 201203；2上海中医药大学附属光华医院·上海 200052)

膝骨关节炎(KOA)是一种以关节软骨进行性退变为核心病理机制的骨关节病变，严重影响中老年人的生活质量。流行病学调查显示，我国40岁及以上人群KOA总患病率为28.7%，且随着年龄增长显著升高，60岁以上人群的患病率高达43.94%[1]，现已成为一项重要的世界性卫生问题。研究表明KOA的发病过程与软骨代谢机制存在一定关联，但其具体发病机制尚不明确，有研究认为机械力通过NF-κB信号通路对细胞形态、功能的调节有重要影响，抑制NF-κB信号通路的活化，有助于保护关节软骨[2]。推拿手法治疗KOA的临床疗效确切，但其对软骨修复的作用仍存在争议，多以离体、动物实验或在体影像学MRI对比研究为主，目前缺少治疗后直接软骨观察证据[3-4]。本研究采用中医推拿手法和全膝关节置换术(TKA)治疗KOA患者，并分析其对软骨细胞NF-κB信号通路、iNOS表达水平的影响，旨在研究推拿手法治疗对关节软骨的修复效果及作用机制，为KOA的临床治疗提供理论依据。

1 临床资料

本研究病例均来源于上海市光华中西医结合医院骨科。纳入标准：①均符合美国风湿病学会1995年制订的《膝关节骨性关节炎诊断标准》[5]，且经放射检查确诊。②年龄在40～65 岁，且符合TKA适应症。③无严重基础疾病。④均已达成共识，并签署知情同意书。排除标准：①膝部有外伤或手术史者；②膝部结核、肿瘤及骨髓炎等患者；③梅毒性神经病、牛皮癣、褐黄病、代谢性骨病、急性创伤等患者；④有药物过敏史者；⑤严重肝肾功能不全、糖尿病、严重心血管疾病及精神疾病者。

根据上述标准共收集20例KOA患者，先行推拿手法治疗再行TKA患膝取材。其中男9例，女11例；年龄42～65岁，平均(53.8±4.9)岁；病程3～11年，平均(5.8±1.9)年；术前膝关节活动度5°～100°，平均(41.7°±5.8°)。将患者按照随机数字表法随机分为A组(推拿手法组)、B组(空白对照组)，每组10 例。两组的性别构成比、年龄、病程、关节功能等基本资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究设计符合《赫尔辛基宣言》，均获得患者的知情同意并签署知情同意书。

2 方法

2.1 治疗方法

A组：采用推拿治疗配合拔伸，每周3次，每次20 min，疗程为3个月。操作手法[6]：先取仰卧位，于患侧股前、内、外侧肌群行法，于患侧膝关节周围(伏兔、犊鼻、梁丘、鹤顶膝眼、血海、足三里、阴陵泉、阳陵泉、阿是穴、三阴交)行按揉法。调整体位至俯卧位，于大腿后侧、腘窝及小腿后部肌群行法，于委阳、委中、合阳、承山、阴谷、阳谷行按揉法。法操作频率120～140 次/min。膝关节拔伸牵引：双手握持小腿远端，拔伸并持续2 s，力量以膝关节有牵开感为度，反复5 次，然后用同样的方法牵引30 s。

B组：通过门诊健教处方发放、健康讲座、电话咨询等方式进行健康宣教，疗程3个月。A组与B组在3个月的疗程结束后，行TKA术取其患膝软骨。

2.2 观察指标

2.2.1 膝关节功能评定 患者均于治疗前、治疗后3个月采用美国特种外科医院评分(HSS)[7]评定膝关节功能。HSS评分包含疼痛(30分)、功能(22分)、活动范围(18分)、肌力(10分)、屈曲畸形(10分)、关节稳定性(10分)6 个维度，分值范围为0～100 分。评分越高，说明关节功能恢复越好。

2.2.2 膝关节软骨生物力学测定 将TKA术后患膝关节软骨，以浸泡过生理盐水的纱布包裹并装入密封袋中，置于-20 ℃低温冰箱中保存待测。保存10～15 d，实验前取出标本，在常温下解冻后，用骨刀沿膝关节软骨的细微裂隙方向切取软骨，修整成哑铃形小试样。用生理盐水洗浴拉伸配件后，将关节软骨标本两端固定于MTS(万能测试机)上准备实验。①应力松弛测试：以5 mm/min拉伸韧带，直至试样长度的5%并维持不变。从t(0)开始釆集数据，采集间隔为0.1 s，采集时间为1 800 s。②蠕变测试：以5 mm/min进行拉伸，达到4 MPa时，停止拉伸，保持应力4 MPa不变，开始釆集数据。计算机数据采集程序与应力松弛测试相同。

2.2.3 膝关节软骨细胞损伤程度、软骨基质蛋白多糖酵解程度改变 ①采用HE染色，评估软骨细胞损伤程度改变，评估指标包括：软骨厚度、表面纤维化程度、软骨基质黏液变性程度、软骨细胞数目减少程度、软骨细胞死亡程度、垂直线性裂隙、钙化紊乱程度、软骨细胞再生。②使用HE染色及番红染色，评估软骨基质蛋白多糖酵解程度。

2.2.4 膝关节软骨NF-κB、iNOS蛋白表达 采用Western blot检测软骨细胞NF-κB及iNOS蛋白表达水平。采用RIPA蛋白裂解法提取关节软骨组织的总蛋白，按BCA法检测iNOS蛋白含量，上样后行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；通过电转移将蛋白转移至硝酸纤维素膜，3%BSA封闭l h，加入一抗后置于4 ℃冰箱过夜；洗膜，加入二抗室温孵育2 h，再洗膜，加入ECL显色试剂，曝光，显影。Western Blot结果采用Bandscan5.0软件行结果分析。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 两组患者治疗前后HSS评分比较 见表1。

表1 两组患者治疗前后HSS评分比较分)

3.2 两组患者软骨应力松弛与蠕变测试结果比较 见表2。

表2 两组患者软骨应力松弛与蠕变测试结果比较

3.3 两组患者软骨细胞损伤程度、软骨基质蛋白多糖酵解程度改变比较 见图1～图2。

图1 两组患者软骨细胞损伤程度改变比较

图2 两组患者软骨基质蛋白多糖酵解程度比较

3.4 两组患者软骨细胞NF-κB、iNOS蛋白表达水平比较 见图3。

注：与A组比较，*P<0.05图3 两组患者软骨细胞NF-κB及iNOS蛋白表达Western blot 检测结果

4 讨论

目前，关于KOA的发病机制有多种学说，包括软骨细胞凋亡、自身免疫反应、软骨下骨内高压、自由基、细胞因子学说等，认为是由内外环境失衡及二者之间的相互影响、互为因果的生物过程导致KOA的发生，其中软骨细胞功能不全对KOA的演变愈发引起重视[8]。膝关节是结构最复杂而最易受损伤的人体关节之一，其表面的关节软骨作为一种多孔的黏弹性材料，可提供润滑良好的关节面，同时其传导分散应力、抗压等特性可保护关节骨骼对冲击力的损伤[9]。因此，研究应力应变不仅对于了解膝关节软骨传递载荷的特性十分必要，而且对于保护、修复关节软骨具有重要意义。

祖国医学认为，KOA属于“骨痹”“痹证”等范畴，其主要病机为经络气血阻滞；内在因素在于气血营卫内虚，风寒湿邪外袭则是其外在因素。《素问·上古天真论》曰：“肾气盛，齿更发长，肾气平均，故真牙生而长极。筋骨坚，发长极，筋骨劲强，肌肉满壮。”《素问·脉要精微论》有记载：“膝者筋之府，屈伸不能，行则偻附，筋将惫矣。”由此可见，肾虚不能主骨生髓；肝肾同源，肾虚则肝亦虚，肝虚则无以养筋以束骨、利关节；筋骨充养不足，则萎软无力，逐渐演变为筋骨枯萎而出现软骨的退行性改变。推拿是中医常用的手法，通过产生不同形式的动态力信号，作用于关节周围感受器，发放动作电位并经神经中枢的整合与反馈，发挥手法的治疗作用[10]。大量研究表明，拔伸类手法能够扩大关节间隙，降低关节内压力，改善静脉回流，降低骨内压，同时还有利于缓解肌张力，增加关节活动度，改善关节功能[11-12]。本研究结果也显示，A组手法治疗后HSS评分明显高于B组 (P<0.05)，进一步证实中医手法可有效改善KOA患者的疼痛、关节功能，提高生活质量。周舒心等[13]报道称，特色中医手法可有效改善局部微循环，增加血管元气和筋骨营养，增加骨生成，从而提高局部关节的稳定性。

本研究先行手法干预再行TKA术，剥离关节软骨直接观察，结果显示，与B组比较，A组最大应力明显增加，而蠕变率、应力松弛率则明显降低 (P<0.05)，与程国杰等[14]研究结果相符，直接证实了机械外力干扰可导致软骨细胞行为改变，手法治疗对KOA的关节软骨具有修复作用。手法通过对膝关节周围肌肉、韧带等软组织的力学平衡调整打破KOA发生发展的恶性循环过程，达到治疗关节软骨退化的效果；但其具体分子生物学作用机制尚不十分清楚[15]。NF-κB是与炎症、免疫等反应相关细胞的信号转导中枢及关键蛋白，在KOA滑膜组织、膝关节周围肌肉中表达升高，同时高水平的NF-κB通过促进IL-1β、TNF-α等炎性因子表达，进而调控NO活性，促进软骨细胞凋亡和软骨破坏[16-17]。本组病例发现，中医手法治疗后软骨细胞NF-κB、iNOS相对表达量显著降低 (P<0.05)；提示由NF-κB信号通路介导的手法可发挥KOA治疗作用，手法治疗可能参与了抑制NF-κB信号通路的活化，下调骨关节炎软骨iNOS蛋白的表达，促进软骨细胞增殖，从而保护骨关节软骨。

综上所述，中医手法对KOA具有确切的临床疗效，可减轻关节疼痛和僵硬，改善关节功能，同时可通过NF-κB信号通路介导软骨的修复作用，提示NF-κB信号通路有望成为抑制KOA炎症反应、保护关节软骨新的分子靶点。