氯霉素泼尼松搽剂治疗小鼠特应性皮炎的实验研究

陈芳，袁昊，马朝晖，陈少秀，常明泉

(1.十堰市太和医院，湖北十堰 442000；2.湖北医药学院，湖北十堰 442000)

特应性皮炎因为产生强烈的瘙痒感，严重影响患者身心健康，导致患者生活质量下降[1-2]。儿童发病率高于成人，达20%[3]。引起特应性皮炎的因素可能有外在因素包括环境、饮食、日照等，内在因素包括免疫功能异常、遗传、精神等[4]。氯霉素泼尼松搽剂是十堰市太和医院自制外用制剂，批准文号为鄂药制字H20111437，规格10 mL，该制剂主要由醋酸泼尼松、氯霉素、无水乙醇、蓖麻油、白及多糖、清鱼肝油组成，具有抗菌消炎、抗变态反应的作用[5-6]，目前主要用于脓疱疮、蚊虫叮咬的治疗，临床上也用于多种变态型皮肤炎症的治疗，取得了良好的效果。为了给临床合理、安全、有效用药提供依据，拓展临床应用范围，作者探索应用二硝基氯苯(DNCB)丙酮溶液对小鼠造模，对该制剂治疗急性特应性皮炎的效果进行研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

VIVASCOP 1500激光共聚焦扫描显微镜(皮肤CT，美国LUCID INC，波长830 nm)；TGL-16G台式离心机(上海安亭医疗器械公司)；UV1901紫外分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)；FST型6 mm/11.5 cm耳打孔器(瑞士)；ZR-08型小鼠固定器(上海普辛仪器科技有限公司)。

1.2 试药

低剂量氯霉素泼尼松搽剂(含氯霉素5 mg/mL、泼尼松0.25 mg/mL，临时配制)；中剂量氯霉素泼尼松搽剂(即正常处方氯霉素泼尼松搽剂，含氯霉素10 mg/mL、泼尼松0.5 mg/mL，临时配制)；高剂量氯霉素泼尼松搽剂(含氯霉素20 mg/mL、泼尼松1 mg/mL，临时配制)；1%吡美莫司乳膏(德国美达医药股份有限公司，批号20180410)；干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、免疫球蛋白E(IgE)酶联免疫检测试剂盒(美国，Invitrogen公司，批号20180922)；二硝基氯苯(武汉江岸化试有限公司，批号20181206)；0.9%氯化钠注射液(生理盐水，每瓶250 mL，四川科伦药业股份有限公司，批号U18090604-4)；丙酮(武汉江岸化试有限公司，批号20180406，化学纯)；十二烷基硫酸钠(SDS，苏州同丰化工有限公司，批号20180922，化学纯)。

1.3 实验动物

C57BL/6/ICR小鼠，体质量25～30 g，来源于湖北医药学院动物实验中心，生产许可证[SCXK(鄂)2016-0008]，使用许可证[SYXK(鄂)2016-0031]。饲养条件：温度20～24 ℃，相对湿度40%～70%，实验过程中供给专用饲料及饮水，实验期间小鼠自由饮食饮水。本研究的动物实验在十堰市太和医院皮肤病研究所完成。

2 方法

2.1 动物造模[7-8]

取合格小鼠48只，雌雄各半，均分为6组，即空白组、模型组、对照组及实验低、中、高剂量组共6组各 8只，规范饲养7 d，实验前1 d用电动剃须刀剃去小鼠背部及双侧耳部毛发，面积约为2 cm2，实验第1～2天，在每只小鼠背部剃毛处涂抹1%二硝基氯苯丙酮溶液100 μL致敏，空白组涂抹不含二硝基氯苯的丙酮溶液100 μL，第3～7 天不对小鼠进行任何处理，第8～16天先用4% SDS清理小鼠背部和耳部剃毛处，待干燥，背部给予0.5% 二硝基氯苯丙酮溶液100 μL再次致敏，左耳部给予0.5%二硝基氯苯丙酮溶液25 μL致敏，空白组给予同剂量不含二硝基氯苯的丙酮溶液，至小鼠皮肤出现表皮剥脱、结痂、红斑、渗出、出血，耳朵出现明显肿胀，即视为造模成功。

2.2 给药方法

造模成功24 h后，对各组小鼠给予相应药物治疗，即空白组和模型组给予生理盐水0.05 mL/cm2，对照组给予1%吡美莫司乳膏0.05 g/cm2，实验组低、中、高剂量组分别给予相应浓度的氯霉素泼尼松搽剂0.05 mL/cm2，每日1次，持续给药7 d(1个疗程)。

2.3 观察指标

每次给药前，注意观察特应性皮炎部位的表象特征变化，记录拍照；检测小鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-5、IgE水平；测定小鼠皮损厚度、耳肿胀度、胸腺指数、脾脏指数，依据皮损程度、各项生化、病理指标的变化情况判断氯霉素泼尼松搽剂对小鼠特应性皮炎的治疗效果。

2.4 检测方法

持续给药7 d，末次给药24 h后，用注射器从小鼠眼眶取静脉血，抗凝处理后在4 ℃环境下，2 000 r/min离心 30 min，取血清于-20 ℃冷冻箱中储存，按酶联免疫法检测IFN-γ、IL-4、IL-5、IgE水平，比较实验组小鼠特应性皮炎应用氯霉素泼尼松搽剂后症状改善与相关生化指标变化的关系。

取上述抽血后的各组小鼠，在共聚焦扫描显微镜下准确定位对皮损厚度进行测定，记录测定结果。取测定皮损厚度后的小鼠,脱颈处死，左右耳对应部位分别用直径6 mm的打孔器打取相同面积的耳片，用分析天平称取双耳片质量，计算耳肿胀度[耳肿胀度=左耳质量(mg)-右耳质量(mg)]；摘取胸腺和脾腺，用分析天平称重，计算胸腺指数[胸腺指数=胸腺质量(mg)/体质量(g)×10]；计算脾脏指数[脾脏指数=脾脏质量(mg)/体质量(g)×10]。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 皮损情况观察

用药过程中肉眼观察、记录、比较各组小鼠特应性皮炎的表象变化，实验组高、中剂量组1个疗程后表皮剥脱、渗出、出血现象消失，结痂减少，红斑开始变浅，耳肿胀程度减轻。

3.2 生化指标比较

治疗后，实验组IL-4、IL-5、IgE水平均受到不同程度抑制，低、中、高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；实验组IFN-γ水平升高，其中中、高剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 6组小鼠生化指标检测结果 pg/mL

3.3 病理指标比较

治疗后，实验组小鼠耳肿胀度、胸腺指数、脾脏指数、皮损厚度中剂量组和高剂量组与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，中剂量组耳肿胀度、胸腺指数、脾脏指数、皮损厚度与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，实验组耳肿胀度随剂量增加依次降低，治疗效果与剂量具有相关性，见表2。

表2 6组小鼠病理指标检测结果

4 讨论

特应性皮炎的发生与细菌、真菌感染、外界环境刺激、体内毒性物质分泌过多有关，生化、病理指标则表现为血清IgE水平增高，IFN-γ水平降低，Th1型细胞功能下降，Th2型细胞功能亢进，Th1/Th2细胞比例失衡[9]。特应性皮炎动物血清中IgE水平与病情严重程度呈正相关[10-11]，特应性皮炎症状加重则IgE水平升高。IFN-γ增高对IgE具有抑制作用。所以实验组小鼠血清中的IgE水平明显高于空白组。Th1型细胞抑制Th2型细胞合成，通过调节Th1/Th2细胞因子平衡有效控制炎症因子水平[12]。因而提高IFN-γ、降低IgE、使Th1/Th2细胞达到动态平衡对特应性皮炎的治疗具有重要意义[13]。

本实验结果显示，氯霉素泼尼松搽剂使用1个疗程后，小鼠表皮剥脱、炎性渗出、出血现象消失，结痂、红斑等得到改善。从生化指标看，氯霉素泼尼松搽剂使用1个疗程后，显著提高了小鼠血清中IFN-γ水平，同时降低了IL-4、IL-5及IgE水平，也可能提高了Th1型细胞功能，抑制了Th2型细胞功能亢进，对Th1/Th2细胞因子平衡发挥了良好的调节作用。病理指标方面，氯霉素泼尼松搽剂应用1个疗程后，小鼠耳肿胀度、皮损厚度与模型组比较显著降低，中、高剂量组的胸腺指数、脾脏指数比模型组显著降低，说明氯霉素泼尼松搽剂用于小鼠特应性皮炎治疗1个疗程后，体征、生化指标、病理指标均获得正向改善。

氯霉素泼尼松搽剂通过脂溶性可弥散进入细菌细胞内抑制蛋白质的合成而达到抗菌消炎目的；抑制、延迟细胞介导免疫反应、过敏反应，降低免疫球蛋白与细胞表面受体的结合并抑制白介素的合成与释放而产生免疫抑制作用；作用于皮损部位降低细胞膜及毛细血管的通透性，从而抑制皮损部位感染；抑制毒性物质、组胺的形成和释放，从而抑制炎性渗出物预防感染加深。该搽剂用于耳、胸腹部，经皮下吸收后，对因DNCB刺激引起的变态反应导致的耳肿胀、胸腺、脾腺肿大具有显著的抑制作用，直接作用于皮损部位，对小鼠背部、左耳因DNCB刺激引起的皮肤剥脱、过敏导致的红斑、肿胀等症状具有显著的改善作用。

吡美莫司乳膏是一种治疗非免疫受损的轻中度特应性皮炎药物[14-15]，临床应用广泛，其疗效得到充分肯定。实验组的中、高剂量组多项治疗指标与对照组比较差异无统计学意义，说明氯霉素泼尼松搽剂对特异性皮炎的治疗同样能产生显著疗效，根据实验结果推论，氯霉素泼尼松搽剂在临床上可用于特应性皮炎、变态反应性皮炎、湿疹的治疗。