咳喘浸手浴足Ⅰ号挥发性成分的顶空-气相色谱-质谱分析

金实，肖锋，胡晓雪，段雪云，熊义涛，王金波，李成银，孙婉瑾

(1.湖北省中医院，湖北武汉 430061；2.湖北省中医药研究院，湖北武汉 430074)

中医内病外治法应用历史悠久，早在《黄帝内经》和《伤寒杂病论》中就有相关记载[1]。清代吴师机《理瀹骈文》阐述了经络的作用，认为外治法是通过体表经络到达体内而发挥治疗作用。依据十二经脉循行走向，手太阴肺经循行由肺至手，因此可通过浸手法从肺论治咳喘[2]；足太阴脾经循行由足至脾，而脾为生痰之源，故咳喘合并痰多的可通过泡足法由脾论治[3]。小儿脏腑娇弱、肺卫不固，外感寒邪易侵入肺卫，肺失宣降而发咳嗽；另外，小儿脾常不足、脾虚不运，阻遏肺气，肺气上逆而积湿生痰。基于以上生理病理特点，小儿哮喘、肺炎、支气管炎等常有咳喘含痰之症[4]。但是小儿应用口服药和注射剂等治疗顺应性差，副作用大[5-6]，因此，应用中药进行浸手浴足是治疗小儿咳喘的佳选，且小儿皮肤薄嫩，透皮吸收效果更佳。

咳喘浸手浴足Ⅰ号是我院儿科刘晓鹰教授经验方，在临床应用数年，深受患者好评。其处方由麻黄、细辛、桂枝、吴茱萸及鹅不食草组成，药材粗粉加适量沸水进行熏蒸，水温合适后浸手浴足。麻黄、细辛、桂枝、吴茱萸、鹅不食草等均含有丰富的挥发性成分[7-11]，有报道证明麻黄、细辛、吴茱萸和鹅不食草挥发油均具有平喘功效[12-15]。并且越来越多的研究表明中药挥发性成分中的单萜和倍半萜类天然化合物具有促进透皮吸收的作用，其特点为起效快、促渗作用强、不良反应少等[16-19]，主要促渗机制为扰乱皮肤角质层的高度有序排列、“拉动效应”及增强皮肤角质层的水合作用等[20]。

本研究采用顶空-气相色谱-质谱(HS-GC-MS)联用方法进行咳喘浸手浴足Ⅰ号挥发性成分分析，确立共有特征峰，并进行指认。对其中可能存在的活性成分和促进透皮吸收的成分进行定性分析，为该制剂的后续研究开发提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)，包含7697A型顶空进样器、G4513A型自动进样器、Agilent DB-5MS毛细管色谱柱(0.25 μm×0.25 mm×30 m)、Agilent Masshunter Qualitative Analysis定性工作站、NIST17型质谱数据库；真空机械泵(德国Pfeiffer Vacuum公司)；ES2252SM-DR十万分之一天平(瑞士Precisa公司)；高纯氦气(纯度≥99.999%，武汉华星工业技术有限公司)。

1.2 试药

麻黄、细辛、桂枝、吴茱萸及鹅不食草，经湖北省中医院主任药师段雪云鉴定，符合《中国药典》2015版一部要求。处方量五味药材混合后40目粗粉制备咳喘浸手浴足Ⅰ号，本实验所用10批供试品[S1～S10，批号分别为20190501(分装)、20190501、20190102、20181201、20181001、20180701、20180518、20180501、20180323、20180110]均由湖北省中医院制剂中心生产。

2 方法与结果

2.1 挥发性成分的提取

咳喘浸手浴足Ⅰ号在临床使用的方法是药材混合粗粉加适量沸水(100 ℃)持续加热进行熏蒸，停止加热待水温合适后浸手浴足。参考应用HS-GC-MS技术对麻黄、细辛和吴茱萸进行成分分析的文献[8，10，21]，并在一定的温度范围内进行预实验，确认顶空提取挥发性成分的方法条件。

精密称取各批次咳喘浸手浴足Ⅰ号供试品0.5 g，置于10 mL顶空进样瓶中，封口密闭，依次置顶空进样器中按以下条件进样：样品瓶加热温度100 ℃，定量环温度105 ℃，传输线温度110 ℃，加热40 min，提取咳喘浸手浴足Ⅰ号易挥发性成分进行分析。

2.2 气相色谱及质谱条件

色谱条件：载气为高纯氦气(纯度≥99.999%)，载气流量 1.0 mL/min；分流比100︰1，进样口温度200 ℃，进样量1 μL；程序升温：初始温度40 ℃，保持3 min，以 4 ℃/min 升至120 ℃，保持5 min，以8 ℃/min升至 160 ℃，保持5 min。

质谱条件：电离方式EI，轰击电压70 eV，正离子模式，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，数据采集模式为全扫描[22]。

2.3 化学成分分析

按实验设计条件测定各批咳喘足浴方挥发性成分，提取电元文件，进行比对，建立咳喘浸手浴足Ⅰ号挥发性成分共有图谱(见图1)，得到17个共有峰，谱库检索结合文献进行识别，共识别出17种成分，保留时间、化学名称、分子式和相对总成分的百分含量等相应信息见表1。识别出3号峰为1R-(+)- α-蒎烯，5号峰为β-蒎烯，6号峰为月桂烯，7号峰为3-蒈烯，8号峰为D-柠檬烯，12号峰为2,3,5,6-四甲基吡嗪，以上几种成分为处方药材挥发油中主要成分，来源明确，归属可靠，并且在气相色谱图中分离较好。

图1 咳喘浸手浴足Ⅰ号挥发性成分总离子共有图谱

表1 咳喘浸手浴足Ⅰ号挥发性成分分析

3 讨论

咳喘浸手浴足Ⅰ号是我院儿科刘晓鹰教授经验方，辨证与辨病相结合，针对小儿咳喘的主要发病机制，反复甄选药味组方而成，全方辛温宣肺、降逆化痰，适用于风寒犯肺、风寒闭肺及寒性哮喘。麻黄、细辛、桂枝和鹅不食草均属于辛温解表、发散风寒之药，其中麻黄宣肺平喘，细辛温肺化饮，桂枝平冲降气，鹅不食草则通鼻窍、止咳；吴茱萸属辛热温里药，可散寒止痛，降逆止呕[23]。方中5味药材皆味辛，与所含丰富的挥发性成分密切相关[24]。麻黄、细辛、桂枝、吴茱萸、鹅不食草等均含有丰富的挥发性成分[7-11]，具有平喘相关功效[12-15]。

本研究采用HS-GC-MS技术对咳喘浸手浴足Ⅰ号进行挥发性成分分析，结合临床实际使用该制剂的方法，参考相关文献报道[8，10，21]确立样品瓶加热温度为100 ℃；根据HS-GC-MS设备的技术要求，传输线温度要适当高于定量环温度，定量环温度要适当高于样品加热瓶温度，确立定量环温度105 ℃，传输线温度110 ℃。如果条件温度过低不符合实际应用情况，温度过高会影响结果重现性。通过顶空进样提取挥发性成分后进行GC-MS分析，建立该制剂的挥发性成分HS-GC-MS图谱，找到17个共有成分，进行识别，充分反映出挥发性成分的组成情况。

本研究识别出的17个共有化合物均有相关文献支持来自麻黄、细辛、桂枝、吴茱萸及鹅不食草，结合谱库检索进行匹配，可以识别为表2列出的相应化合物。早在1983年，孙静芸[25]就从麻黄平喘有效部位分离出了两个具有平喘作用的单体，本研究中的No.12化合物2,3,5,6-四甲基吡嗪即是其中之一。2,3,5,6-四甲基吡嗪(川芎嗪)应用于小儿哮喘的临床研究报道也越来越多[26-28]，可能作用机制为：扩张哮喘患者支气管[29-30]；明显抑制慢性和非特异性炎症[31]；促进内皮细胞释放内皮依赖性血管舒张因子而发挥扩血管作用，从而改善哮喘患者的肺动脉高压[32]；减少哮喘患者的血小板激活因子和血栓素A2水平[33]。

咳喘浸手浴足Ⅰ号中麻黄、桂枝和细辛均含有D-柠檬烯，故而复方含量高达16.26%。D-柠檬烯是一种中草药挥发油类的透皮吸收剂，不但可以促进川芎嗪的透皮吸收[34]，而且本身也是一种具有镇咳、祛痰和抗菌作用的有效成分；细辛和吴茱萸中含有的α-蒎烯同样具有镇咳、祛痰、抗真菌和促进透皮吸收作用。柠檬烯、α-蒎烯和桉油精能协同起效，用于抗炎、扩张支气管和促使痰液排出，是桉柠蒎肠溶软胶囊的有效成分，口服吸收良好，但其自身的透皮吸收程度还有待验证[35-38]。另外，本研究检测出的月桂烯(No.6)、蒎烯(No.3和No.5)、蒈烯(No.7)等萜类化合物均为天然的经皮给药制剂的促渗剂[20]。

咳喘浸手浴足Ⅰ号中含有的挥发性成份无论是药理作用还是促进透皮吸收作用均与处方用于小儿咳喘治疗相吻合。本研究仅针对本实验条件下的挥发性成分进行分析，不排除处方中非挥发性成分通过透皮吸收进入体内起效，有待进一步研究。川芎嗪为该方可能主要有效成分，但作为注射或者是口服剂型在小儿用药上都有顺应性差和副作用大的劣势，而咳喘浸手浴足Ⅰ号作为外用制剂不仅克服了这些缺点，还有透皮吸收给药方式避免首过效应的优点，为小儿咳喘治疗提供了新的治疗方式。