苦瓜凝集素对小鼠外周血细胞因子和趋化因子表达水平的影响

周 崇，韦舒文，苏洁丽，韩 冰，张近礼，袁富红，黄 莉

（广西中医药大学，广西 南宁 530200）

随着现代社会的高速发展，生活节奏加快、工作压力增强、环境恶化加剧、食品安全问题频出等都可引起人们身体健康问题，尤其是免疫系统受到影响，导致免疫机能下降，易引发多种疾病。免疫增强剂是能增强机体免疫力的一类免疫治疗药物，具有促进和调节免疫应答功能的制剂，临床上常用于治疗与免疫功能低下有关的疾病、免疫缺陷病、慢性感染疾病等。中药免疫增强剂药性温和、耐药性低、毒副作用小，且具有双向调节功能，已引起广大学者的关注和研究兴趣。因此，从我国丰富的中草药资源中寻找和筛选出具备应用潜力的免疫增强剂物质，日渐成为中药免疫增强剂的研究热点和焦点，具有重要的开发应用意义。

苦瓜为葫芦科苦瓜属植物，味甘苦，主作蔬菜，也是一种传统的中药材，含有植物胰岛素、苦瓜凝集素（MCL）、MAP30 等多种药用成分，具有降血糖、抗艾滋病、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强机体免疫力等作用［1-4］。植物凝集素是来源于植物的一类能凝集细胞和沉淀单糖或多糖复合物的非免疫来源的非酶蛋白质，具有细胞凝集、抗病毒、抗真菌及诱导细胞凋亡或自噬等多种能力，参与到如信号转导、免疫反应、植物防御等诸多生物过程，在生命科学、医学及农业方面均有较好的研究价值和应用前景［5］。本课题组前期研究已证实了苦瓜凝集素是具有半乳糖结合特异性的四链Ⅱ型核糖体失活糖蛋白，能凝集如人、小鼠等不同种属来源的红细胞，可有效地增强机体的体液免疫，产生特异性IgG，并且可特异性促进B 淋巴细胞增殖及活化，是B 细胞激动剂［6-8］。研究提示苦瓜凝集素的免疫调节作用可能与调节免疫细胞的细胞因子密切相关。目前，国内外关于苦瓜凝集素对细胞因子的调节作用及其可能机制尚未了解清楚，其相关报道也较少。鉴于细胞因子数量众多，常规的ELISA 检测方法不利于大规模筛选检测，本研究采用新型高通量液相芯片检测分析技术，利用Bio-Plex Pro 小鼠细胞因子23-plex 检测试剂盒，对比分析苦瓜凝集素处理组和空白对照组BALB/c 小鼠外周血中多种细胞因子和趋化因子的动态变化，以明确苦瓜凝集素对机体的免疫调节作用，为进一步发掘苦瓜凝集素的临床应用价值，开发新型生物制剂如免疫增强剂提供实验依据。

1 材料和方法

1.1试药 参照王海仁等［9］的制备方法，从苦瓜籽中分离得到苦瓜凝集素。将获得的苦瓜凝集素用磷酸盐缓冲液（PBS）溶液经2倍倍比稀释后，与BALB/c小鼠红细胞悬液混合均匀，室温静置30 min，检测验证其具有红细胞凝集活性，且对小鼠红细胞的凝集效价为213，用Bradford 方法测出其蛋白含量为13 g/L。

1.2实验方法

1.2.1动物实验和样品处理 BALB/c 小鼠，雌性，6～8 周，适应饲养1 周后，随机分为空白对照组和苦瓜凝集素处理组，每组15 只，分别在小鼠右后腿处肌肉注射PBS 或苦瓜凝集素（浓度6.5 μg/µl），注射容量均为每只20 µl。注射后1 h、4 h、8 h、18 h和24 h，各组采集3 只小鼠的外周血，分离血清，留存待用。

1.2.2细胞因子检测 利用Bio-Plex Pro 小鼠细胞因子23-plex 检测试剂盒（Bio-Rad Pro，Bio-Rad Laboratories，USA），包含IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13，IL-17，TNF-α，G-CSF，GM-CSF，IFN-γ，MIP-1α，RANTES，MIP-1β，Eotaxin，MCP-1 和KC，检测小鼠血清中的细胞因子浓度。具体测定过程依据试剂盒的使用说明进行操作。根据标准品浓度及对应OD 值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD 值在直线回归方程上计算出相对应的样品浓度。其中，G-CSF 在样品中浓度过高，超出Bio-Plex Pro 小鼠细胞因子23-plex 检测试剂盒的检测范围，将样品稀释后，利用小鼠G-CSF Quantikine ELISA 试剂盒（R&D system，Minneapolis，USA），按照试剂盒的使用说明进行操作，检测样品中浓度。

1.3数据统计及分析 实验数据以均数±标准差（±s）表示，利用Excel 软件中Student’st检验进行分析，P<0.05表示差异有显著性意义，P<0.01表示差异有极显著性意义，P<0.001表示差异有极极显著性意义。

2 结果与分析

2.1苦瓜凝集素对IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IL-12（p40）、GM-CSF 和G-CSF 等细胞因子的影响见图1、表1。

如图1 所示，接受苦瓜凝集素肌肉注射24 h 内，小鼠血中细胞因子均有不同程度的表达变化。变化幅度最显著的是G-CSF，血中浓度很高，峰值达到（16 604.90±3 762.43）pg/ml（P<0.001），其次是TNF-α、IL-12（p40）和IL-1α，峰值也分别达到（3 278.93±667.27）pg/ml（P<0.001），（3 199.17±1 353.49）pg/ml（P<0.05）和（515.73±60.48）pg/ml（P<0.001），IL-6、IL-10和IL-1β次之，峰值分别为（230.60±18.79）pg/ml（P<0.001）、（230.62±18.79）pg/ml（P<0.001）和（216.11±57.92）pg/ml（P<0.01）；GM-CSF 的变化幅度最低，峰值仅为（99.53±14.27）pg/ml（P<0.01）。值得注意的是，TNF-α、IL-6 和IL-10 呈现相似的变化趋势，在外周血中浓度均是刺激后急剧上升，在刺激后1 h 时即达到峰值（P<0.01，P<0.001，P<0.001），然后下调，在刺激后4 h 达到最低值，随后持续上调表达。IL-1α、IL-1β 和G-CSF 的表达趋势基本类似，尤其是G-CSF，在整个试验周期内保持高水平的持续表达，在刺激后2 h 或4 h 达到峰值，之后作用时间内表达水平稍有起伏波动。GM-CSF 在整个试验周期内呈现出持续上调表达趋势。IL-12（p40）尽管在刺激后1 h 逐渐上升，在2 h 达到峰值，但是随即下调至与对照组相当的表达水平。

图1 苦瓜凝集素诱导后小鼠外周血细胞因子的表达变化

表1显示，与对照组比较，苦瓜凝集素能显著上调IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、G-CSF、GM-CSF、IL-12（p40）等细胞因子的表达水平。

表1 苦瓜凝集素诱导后小鼠外周血中细胞因子的表达变化 （pg/ml，x±s）

续表1

2.2苦瓜凝集素对RANTES、Eotaxin、MCP-1、KC、MIP-1α和MIP-1β等趋化因子的影响 见图2、表2。

从图2 可以看出苦瓜凝集素刺激后，小鼠外周血中RANTES、Eotaxin、MCP-1 和KC 显著上调表达，并且上调幅度很大。其中增幅最大的是MCP-1和KC，其峰值分别达到（8 620.55±77.31）pg/ml（P<0.001）和（8 154.5±891.73）pg/ml（P<0.001），其次RANTES和Eotaxin峰值则分别达到在（3 317.40±1 384.39）pg/ml（P<0.05）和（3 049.6±545.37）pg/ml（P<0.01），增幅最小的是MIP-1 β［峰值为（707.08±261.06）pg/ml，P<0.05］。RANTES 和Eotaxin 均是在MCL 刺激后1 h快速增长，在4 h 达到峰值，但是RANTES 在随后逐渐表达下调，而Eotaxin 则进入表达的平台期，持续高水平表达，24 h 又稍上调。MCP-1、MIP-1β 和KC 呈现相似的变化趋势，苦瓜凝集素刺激后1 h表达上调，在2 h 即迅速达到峰值，并且表达量数倍地远高于整个实验周期的其他时间点，随后迅速下降。其中MCP-1 在4 h 后表达量维持在（1 496.34±54.98）～（928.12±41.53）pg/ml 的高水平范围（P<0.01，P<0.001）；KC 表 达 则 在4 h 下 降 至（2 489.22±377.69）pg/ml（P<0.001），然后表达水平进一步下调，至试验结束表达量维持在（481.30±194.99）～（668.87±89.52）pg/ml范围（P<0.05，P<0.001）；MIP-1β 的表达量在4～24 h 时间点维持在（84.72±11.85）～（235.93±37.47）pg/ml 的范围（P<0.001）。MIP-1α 在刺激后1 h 迅速显著性上调表达，2 h继续上升，达到峰值，随后表达逐渐下调，直至试验结束。表2显示，苦瓜凝集素能促使小鼠外周血产生高水平的趋化因子表达，尤其是RANTES、Eotaxin、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和KC等趋化因子。

图2 苦瓜凝集素诱导后小鼠外周血趋化因子的表达变化

表2 苦瓜凝集素诱导后小鼠外周血中区划因子的表达变化 （pg/ml，x±s）

续表2

3 讨 论

植物凝集素由于其特异性的糖结合活性，可参与到许多生物学过程中，并发挥着重要的作用，作为一类潜在的生物试剂，具有极其广阔的开发和应用前景。细胞因子具有免疫调节和效应功能，介导免疫细胞的活化、生长及分化，参与天然免疫和获得性免疫过程，并作为细胞间信号，在局部或全身的免疫应答、炎症反应等方面发挥着重要作用。本研究分析苦瓜凝集素对机体细胞因子表达的影响，以进一步探讨苦瓜凝集素对机体免疫系统的调控作用。

本试验的数据结果显示，苦瓜凝集素刺激小鼠4 h内，即诱导产生高水平的促炎细胞因子如IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α等，提示苦瓜凝集素具有免疫调控的生物活性。GAUTO等［10］发现从Korean mistletoe中分离到的一种凝集素，能诱导巨噬细胞，促进多种细胞因子（IL-3、TNF-α）的表达和ROS 的产生，进而介导免疫反应，增强巨噬细胞的吞噬作用。PRASANNA 等［11］则 发 现 洋 葱 凝 集 素ACA 处 理RAW264.7 细胞及大鼠腹腔巨噬细胞24 h 后，能明显提高NO、IL-12 和TNF-α 的表达量。IL-1α/β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子，可由活化单核巨噬细胞系统生成，能促进免疫细胞增殖、分化及活化，进而调节介导免疫和炎症反应。值得注意的是，本研究中苦瓜凝集素作用小鼠后，炎症与免疫抑制因子IL-10 也显著性上调表达，且IL-10 和促炎因子IL-6 及TNF-α 呈现相似的表达趋势。IL-10 是一种重要的抗炎因子，主要由单核细胞、淋巴细胞和肥大细胞分泌，调节细胞的生长与分化，进而缓解炎性反应及其对机体的损伤。因此，结果提示IL-10 和IL-6、TNF-α 之间的表达平衡与否，可能决定或影响了机体对苦瓜凝集素的免疫应答方向，也为苦瓜凝集素的临床应用提供参考依据。已有研究表明，植物凝集素的免疫调节活性是它们通过其表面特异性糖结合位点与聚糖发生相互作用，激活免疫细胞表面的受体，进而可能触发TLRs 信号通路，产生细胞因子来调控机体的免疫和炎症反应［12］。本课题组的前期研究已证实苦瓜凝集素具有结合半乳糖羰基的特性，因此，苦瓜凝集素可能通过其特有的糖结合位点结合到免疫细胞，激活免疫细胞，促进产生细胞因子，进而介导机体免疫反应，具体机制需进一步实验验证［8］。

趋化因子是一类由细胞分泌的小细胞因子或信号蛋白，作为免疫炎症性因子，能直接参与细胞的募集、活化，能诱导细胞迁移、细胞脱颗粒，参与到免疫细胞与器官的发育、免疫应答及炎性反应中，发挥重要作用［13］。而免疫细胞在机体趋化效应中的作用程度由趋化因子及其受体的表达所决定［14］。本试验初步考察了苦瓜凝集素对趋化因子表达的影响作用，证实了苦瓜凝集素能促使小鼠外周血中RANTES、Eotaxin、MCP-1、KC、MIP-1α 和MIP-1β 等趋化因子的表达显著上调。Eotaxin 是一种对嗜酸性粒细胞有特异性趋化作用的细胞因子，对血管内皮细胞也具有趋化作用。李莉等［15］发现附子、干姜、肉桂、黄连和栀子等中药水煎剂分别灌胃给予大鼠，大鼠血浆中可检测到Eotaxin表达水平升高。RANTES是单核巨噬细胞系统最强的趋化因子，由巨噬细胞、活性T细胞分泌产生，对单核细胞和记忆性T 细胞等炎性细胞有趋化作用，调节活化正常T 细胞表达与分泌，参与炎症反应和免疫细胞的活化效应［16］。MIP-1α/β 对单核细胞和巨噬细胞具有特异性趋化吸引作用，能与表达于淋巴细胞、巨噬细胞的表面受体CCR5 结合，主要起到招募及细胞迁移的作用，并参与到免疫炎性反应，能调控机体内炎性细胞因子的表达水平，是影响白细胞趋化作用的重要调节者［17］。MCP-1 是对单核细胞和巨噬细胞特异性的化学趋化激活因子，可诱发单核细胞和纤维母细胞迁移到异位灶，尤其是单核细胞，引起细胞内Ca2+浓度增加和呼吸爆发，产生并释放超氧阴离子和溶酶体酶，最终活化成巨噬细胞。多项研究表明MCP-1、RANTES、Eotaxin 等表达水平与机体的免疫应答、炎症及其相关疾病密切相关，通过趋化激活免疫细胞和分泌多种细胞因子及生长因子，产生多重调节和免疫叠加作用，形成复杂的细胞因子级联效应，参与和影响疾病的发生、发展及转归［18］。NAPIMOGA等［19］从丝胶龙果种子分离得到一种凝集素，发现其通过抑制细胞因子TNF-α、IL-1β和趋化因子MIP-1α、KC 的表达水平，来减弱中性粒细胞迁移及其引起的免疫损伤。因此，本试验结果提示苦瓜凝集素可能通过诱导趋化因子如RANTES、Eotaxin、MCP-1、KC、MIP-1α 和MIP-1β 等的表达，来调节免疫细胞的趋化及功能，进而调控机体的免疫应答。

在本试验中，苦瓜凝集素可显著诱使机体上调表达多种细胞因子如IL-1α/β、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12（p40）、G-CSF 和GM-CSF 等，还调节趋化因子如Eotaxin、RANTES、MCP-1、KC、MIP-1α 和MIP-1β等，展示出可作为免疫增强剂的应用潜力，为进一步开发苦瓜凝集素的应用价值提供试验数据。