坐骨神经慢性压迫损伤动物模型的不同制备方法比较＊

刘柏彤，张 薇，蒋一璐，蔡定均

（成都中医药大学针灸推拿学院 成都 610075）

神经病理性疼痛（Neuropathic pain，NPP）是由影响体感神经系统的病变或疾病引起的，主要表现为感觉功能障碍，如自发性疼痛、痛觉过敏、异常疼痛等，在成年人中发病率为6%-8%。神经病理性疼痛与生活质量低下及现有药物相对保守的疗效反应相关。由于其症状表现的多样化及发病机制尚不完全清楚，故为科学研究中的难点之一[1,2]。为了预防和治疗NPP，我们需要清楚NPP的发病机制、治疗方法及其起效机制。目前研究NPP 最常用的动物模型为中枢疼痛模型、周围神经损伤模型以及与化疗、抗艾滋病治疗和糖尿病相关的外周神经痛模型[3]。坐骨神经慢性压迫损伤（Chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI）模型属于周围神经损伤模型，且模型稳定性强，重复性好[4]，故本文选择CCI模型作为研究对象。坐骨神经走行过程中任何地方的紊乱都可引起坐骨神经痛，最常见的部位是在L4-L5和L5-S1水平，较少出现的是在L3-L4 水平。坐骨神经损伤也会在下盆腔、臀部、臀沟和股二头肌等部位发生。在不同的研究中，坐骨神经痛的患病率差异很大，最高的发病率为40%，大多数情况发生在40-60 岁[5]。笔者以坐骨神经慢性压迫损伤动物模型为例，通过结合文献及笔者的实践经验，分析比较不同造模方法的优缺点和适用范围，以期对CCI动物模型的研究提供指导。

1 动物与制备方法的选择

1.1 动物选择

选择一个合适的载体非常重要，实验动物的选择会直接影响到模型成功与否及后续实验能否顺利开展，选择一个合适的实验动物可以准确复制出与人类相同或相似的发病机制，对于治疗起效机制的研究具有指导意义。因此，首先应考虑如何选择实验动物。实验动物的选择应该考虑两个因素，一是种属，二是性别。实验动物种属的选择还应考虑到动物对造模方法的敏感性、特异性、稳定性及经济等要素[6]。根据文献，目前常用来制作CCI 模型的动物有大鼠、小鼠、家兔等。每种动物CCI 模型都具有各自特点：①大鼠性情温顺，生存能力强，体型相对较大，模型成功率较高，是CCI 模型的理想载体。②小鼠生存能力及繁殖力极强，基因组测序表明小鼠与人类平均85%的基因序列高度一致[7]，故小鼠也是CCI 模型较理想的载体。但小鼠体型较小，下肢较细，坐骨神经也较细，不利于观察研究。③家兔性情温顺，生存能力强，且家兔下肢相对较大，便于模型的制备；但相对于大鼠和小鼠，手术的复杂程度要更高。而动物性别差异同样也会对CCI 产生影响，如雌性动物的雌激素水平会影响到其对疼痛刺激的敏感性[8]，因此，除特殊研究需要外，应选择雄性动物。

1.2 制备方法

CCI 动物模型一般与空白组和假手术组相比较。假手术组仅暴露坐骨神经，而不做其他处理。CCI 动物模型的制备方法可以分为两大类：坐骨神经结扎法和硅胶管环形挤压法。结扎法易于上手，模型可获得较高的稳定性；但是缺点在于实际操作中需要准确的手感，若处理不当容易造成模型不成功或坐骨神经损伤。硅胶管环形挤压法易于操作，且受到外力影响较小，故成功率较结扎法高。但硅胶管存在容易脱落的情况，会影响模型的成功；且在一定程度上会影响模型的热痛敏和异常性机械痛敏[9]。

此两种方法在操作难度、模型稳定及成功率等方面各有其特点及优缺点，故应根据实际情况选择。

2 动物模型制备

2.1 大鼠CCI模型的制备

2.1.1 大鼠坐骨神经结扎法

Bennett 和Xie 的大鼠坐骨神经结扎法[10]是最经典的方法，是将大鼠坐骨神经主干部位钝性分离出来，用4-0 铬制羊肠线结扎，每两道之间间隔约1 mm。大鼠坐骨神经结扎法根据结扎数量不同，又分为两种方法，分别为结扎3道和结扎4道。

（1）结扎4道

Bennett 等[10]在手术后1-7 天，观察到大鼠的步态有很大变化，受影响的后爪在行走时笨拙、跛行，在行走或站立时分开的脚趾则会蜷缩，并稍微外翻。大约1周后，跛行有所改善，脚趾蜷缩，外翻明显，大多数大鼠表现出轻度至中度的足下垂，并持续2个多月，且脚趾蜷缩越来越紧。4-6 周后跛行逐渐改善，但大鼠依然用后爪外翻行走。结扎后第2 天开始，结扎侧的后爪机械痛阈明显降低，术后2个月后仍存在这种现象，但痛觉过敏程度逐渐减弱。至3-4 个月后，后肢出现痛觉减退。何林峰等[11]观察到模型组大鼠于术后7天，机械痛阈和热痛阈值表现为降低趋势，并且持续2周的时间（P＜ 0.01或P＜ 0.05）。

（2）结扎3道

韩光等[12]将大鼠分为假手术组和模型组，观察到术后1-7天，与假手术组大鼠相比，模型组大鼠机械痛阈和热痛阈值都显著降低。术后3天左右的机械痛阈和热痛阈值下降幅度最大，后逐渐趋于平稳；林志刚等[13]观察CCI模型组大鼠造模后17天内机械足反射阈值（Paw withdrawal threshold，PWT），发现1、3、5、7、10天PWT 持续下降，于第10 天到达最低水平，于后保持在较平稳水平，与空白组对比具有显著差异（P＜0.01）；术后第18天观察到CCI模型组腓肠肌细胞横截面积明显小于空白组（P＜0.05）；且术后第18 天观察到背根神经节的P 物质（substance P，SP）含量较空白组、假手术组明显升高（P＜ 0.05）

2.1.2 大鼠坐骨神经硅胶管环形挤压法

经典的神经卡压损伤模型是Mackinnon 等[14-16]设计的硅胶管卡压造成的神经慢性损伤模型。是将已消毒的硅胶管（长度为5 mm，管内径与大鼠坐骨神经直径基本一致）套住大鼠坐骨神经，并用缝合线将硅胶管固定以环形挤压坐骨神经。O'Brien 等[16]发现造模3个月时，可见套管处神经受到压迫，远端和近端的神经轻微肿胀，套管处神经被触碰时稍显紧张，最明显的是第8个月和第12个月。造模后大鼠第1个月的组织学评估结果为正常，5个月时神经束膜增厚，中央纤维正常，在神经束的顶端可见明显的脱髓鞘；3个月时，模型组神经传导速度增加，在5-12个月时，速度和振幅逐渐下降，模型组和对照组间的差异具有统计学意义（P＜ 0.01）。杨书蔚等[17]发现造模后第14 天和28天，与空白组比较，造模大鼠坐骨神经功能指数（Sciatic functional Index，SFI）明显降低（P＜ 0.01）。造模后第28天各组大鼠坐骨神经病理形态比较：空白组坐骨神经纤维排列整齐，结构紧密，轴索位于神经内膜中间，各结构清晰可见；模型组坐骨神经纤维及髓鞘排列混乱，髓鞘、轴突出现崩解，部分变形呈空泡状，雪旺细胞增多。

2.2 小鼠CCI模型制备

小鼠坐骨神经结扎法与大鼠坐骨神经结扎法类似，同样也分为结扎3道和结扎4道。

2.2.1 结扎4道

罗裕辉等[18]发现手术后第4 天模型组小鼠的机械痛阈和热痛阈值都比假手术组明显降低（P＜0.05），并一直持续到手术后第6 天。龚华磊等[19]通过测量得到造模前假手术组小鼠手术侧、对侧和CCI 组小鼠结扎侧、对侧后爪机械痛阈和热痛阈值差异无统计学意义（P＞0.05）。造模后7 天，对比假手术组小鼠手术侧、对侧和CCI组小鼠结扎侧、对侧后爪机械痛阈和热痛阈值。发现与假手术组结扎侧比较，CCI 组小鼠患侧后爪机械痛阈和热痛阈值明显降低（P＜0.05）；造模后7 天，假手术组小鼠手术侧、对侧和CCI 组小鼠结扎侧、对侧DRGZHX2 蛋白的表达不同（P＜ 0.05）。与假手术组手术侧比较，CCI组小鼠结扎侧DRGZHX2蛋白的表达增加2.15倍（P＜ 0.05）。

2.2.2 结扎3道

李永丰等[20]发现CCI 组小鼠痛阈比假手术组显著降低，术后14天机械痛阈和热痛阈值均降至最低（P＜0.01）；术后4 天时测得Western blot 结果为损伤区CB1受体的表达水平显著升高（P＜ 0.01），并于7、11 和14天保持较高水平，与手术前相比有差异（P＜0.05）。杨宁等[21]的实验中与空白对照组比较，模型组造模后第1、8、22天的痛阈值明显下降（P＜ 0.05）。

2.3 家兔CCI模型制备

家兔坐骨神经结扎法与大鼠坐骨神经结扎法类似。吴文骏等[22]得到家兔造模3 天后改良Tarlov 评分及趾张反射评分明显降低，2周后开始恢复，6-8周后，趾张反射及步态基本恢复，针刺反应和外力对抗恢复情况不理想，造模后10 周，家兔各项指标基本达到正常水平。

3 讨论

神经病理性疼痛（Neuropathic pain，NPP）占各类慢性疼痛的30%以上，是医护人员在临床工作中遇到的常见疼痛类型[23]。不同类型的免疫细胞如肥大细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞等在NPP的发病中发挥重要作用[24]。研究NPP 的重要一步是建立NPP 动物模型，而CCI 模型是研究NPP 的经典模型。在CCI模型中，挤压神经导致化学促炎物质释放，以侵袭神经组织，最终导致神经炎和神经肥厚，引起机械痛敏和热过敏的现象[4]，与NPP 的发病机制相同或类似，具有较高的代表性。目前CCI 模型常用的动物载体有大鼠、小鼠、家兔等；CCI 动物模型的制备最常用的是坐骨神经结扎法和硅胶管环形挤压法，各具特点。

坐骨神经结扎法较常用。根据笔者的实践经历，结扎时应注意，要注意结扎的松紧程度，以免造成造模不成功或损伤坐骨神经，影响机械痛阈和热痛阈值的结果，甚至造成肢体远端缺血肿胀，甚至坏死，以致动物啃咬结扎侧脚趾。这就需要操作者的大量练习和观察。从结扎使用的羊肠线到结扎时对手感的把控及对神经外膜血运的观察，再到结扎完成后对模型的观察以及相关测量分析，都需要不断总结经验。结扎时用的羊肠线需事先在生理盐水里浸泡，不仅可以防止打结，而且相对于未浸泡的羊肠线，更容易体会结扎的松紧程度；观察神经外膜血运是最直观的观察方式，可观察到有一条动脉和一条静脉伴行，静脉肉眼隐约可见；动脉则需用体视显微镜观察。结扎完毕将大鼠下肢静置几分钟，若静脉变得比较清晰则表明结扎松紧度合适；如有充血现象，则表明结太紧了[9]。家兔和大鼠的坐骨神经较粗，结扎相对容易；而小鼠的坐骨神经较细，在结扎中应注意避免造成坐骨神经的损伤。笔者在搜集文献时发现结扎法在大鼠和小鼠模型中运用时都分为结扎3 道和结扎4 道，根据文献反馈的结果来看，结扎3 道和结扎4 道均可制备出较满意的CCI 模型，两种方法对于造模结果无显著差别；但结扎4 道对于动物行为学的影响比结扎3 道久，更适用于长期观察。

硅胶管环形挤压法中硅胶管本身直径固定且无弹性，故不存在外力影响压迫效果的情况；但硅胶管相对于结扎用的肠线体型较大，产生炎性疼痛的可能性增大，在一定程度上会影响模型的热痛敏和异常性机械痛敏，且容易出现脱落和半脱落的情况。这需要操作者在制备模型时考虑到硅胶管的固定问题，同时又不能对硅胶管产生外力以影响模型的复制。笔者搜集到仅有大鼠采用此方法制备CCI 模型，小鼠没有采用此方法或许与其坐骨神经太细太短，没有相配套的硅胶管有关；而家兔的CCI 模型在搜集资料时得到的文献较少，还欠缺相关研究。但是根据目前搜集到的文献，家兔坐骨神经结扎后10 周各项指标基本恢复[22]，与家兔的恢复能力强有关，所以家兔的坐骨神经结扎模型不利于时间跨度较大的实验。

根据已有文献，坐骨神经结扎法造模后大鼠会出现足外翻或蜷缩的现象，在一定程度上会影响热痛阈的测量，而采用硅胶管环形挤压法造模的大鼠足印长度（Print length，PL）、中间足趾距离（Inter-toes distance，IT）增长[25]，对于热痛阈测量的影响相对小。坐骨神经结扎大鼠于术后第1天即可出现机械痛阈和热痛阈值降低等行为学改变，且具有统计学意义；就目前收集到的文献，采用硅胶管环形挤压法制备的CCI 模型大鼠最早于第9 天可观察到有行为学的改变[25]，较之坐骨神经结扎的大鼠更晚；但坐骨神经结扎的大鼠于3-4 个月后，后肢出现痛觉减退[10]；而硅胶管环形挤压坐骨神经的大鼠痛觉过敏可持续至12 个月[25]。故坐骨神经结扎法适用于CCI 大鼠疼痛模型急性期观察，而硅胶管环形压迫法适用于长期及慢性疾病观察和研究。但是采用坐骨神经结扎法制备的动物模型存在“自噬”现象，容易产生组织破坏和感染，影响观察结果。王金保等[26]改良了这种方法，先用多孔胶片包裹需结扎的部位，再行用羊肠线结扎，减少了动物的“自噬”现象，但运用此方法的后续报道较少，这种方法与传统方法是否存在差异目前尚不清楚。硅胶管环形挤压法制备的动物模型未看到动物被报道出现“自噬”现象，可有效减少其他因素的干扰。

坐骨神经损伤常由腰骶部脊柱疾病、椎管内病变、腰骶软组织劳损引起，临床以椎间盘突出、梨状肌综合征引起者最为多见。目前制备CCI模型的大鼠均在大鼠大腿外侧将大鼠坐骨神经主干部分分离出来，或用羊肠线结扎，或用硅胶管固定环形挤压，其作用机理和表现与梨状肌综合征更为相似。梨状肌综合征急性期，患者在臀部或腰骶部感觉到沿坐骨神经的放射性疼痛，下肢不能伸直，步履跛行[27,28]。这种临床表现与采用坐骨神经结扎法制备CCI模型的大鼠出现的缩足、跛行甚至足外翻，痛觉过敏持续2个月后逐渐消失[10]的表现相似。而梨状肌综合征慢性期患者则表现出小腿外侧的疼痛、麻木、乏力等症状，甚至出现足下垂的表现[28,29]。采用硅胶管环形挤压法制备出的CCI 模型大鼠会有PL、IT 增长的表现，且造模后的热痛阈和机械痛阈自第9 天开始趋于稳定，症状可持续12 个月[25]，都与梨状肌综合征慢性期患者的临床表现相似。但是坐骨神经结扎法制备CCI 模型的大鼠于3-4 个月患肢会出现痛觉减退[10]，也与慢性梨状肌综合征患者临床表现相似，只是目前文献关于长期观察这种方法制备CCI大鼠的记录较少、症状描述较少，故无法对应。而且目前对于CCI 模型评价方法较单一，一般仅观测热痛阈和机械痛阈的改变，但是临床上坐骨神经痛患者的临床表现更多样，这也是后续实验需要完善的地方。

总之，研究NPP 的重要基础首先就是要建立起满意的NPP 动物模型，模型的建立也可以保证研究结果的准确性。目前复制CCI 动物模型的方法经典且成熟，但是某些动物的造模方法过于单一，且不能完全模拟人的发病机制，而且在实际操作中遇到一些无法标准化和模型评价标准欠完善的问题，仍需我们继续探索和创新。