卵巢组织冷冻保存策略的探讨
2021-01-08郑春杨程东凯于洪君李宝山刘双
郑春杨,程东凯,于洪君,李宝山,刘双
(沈阳东方菁华医院,辽宁 沈阳 110000)
0 引言
在一些国家,卵巢组织冷冻保存(OTC)已经在临床环境中进行了20多年,目的是挽救面临非自然加速卵泡丧失的患者的生育能力。据估计,目前全世界有超过1万名女童和妇女接受了OTC治疗[1,2]。手术过程包括切除卵巢组织,然后冷冻皮质组织,使其厚度约为1毫米。冷冻需要使用冷冻保护剂,以避免冰晶的形成和破坏细胞的完整性。目前有几种冷冻介质和方案,卵巢皮质组织冷冻,尤其是卵泡发育的早期阶段似乎对冷冻有很强的抵抗力。该组织储存在液氮中,经过短期储存和17年的冷冻后,卵泡的存活率也很好,这证明了该组织的长期存活率。解冻后,组织可以移植到原来的妇女身上。由于皮质组织主要包含卵泡发育的早期阶段,组织需要3-6个月才能恢复全部活动,包括维持排卵前卵泡的发育和释放可受精的卵母细胞。这项技术已经从主要以动物研究为基础的实验性技术,发展成为一项经过严格验证的临床冷冻技术。实验室调查和临床实践表明,几乎所有妇女在组织移植后都能恢复卵巢功能[3,4]。由于显而易见的原因,卵巢组织移植(OTT)的数量远低于被冷冻卵巢的数量:①患者需要时间从癌症中恢复;②避免一段时间内复发;③一些患者是尚未打算生育的年轻女孩,她们的储存期预计为10-20年甚至更长;④一些妇女尽管接受了促性腺激素毒性治疗,但仍能维持月经周期,可能不需要冷冻保存组织来繁殖;⑤一些患者可能无法存活。
OTC被用于保存生殖腺毒性治疗的恶性疾病或非恶性疾病患者的生育能力,例如全身性红斑狼疮,但患有罕见遗传疾病的妇女也受益于OTC。癌症疾病仍然是使用OTC的主要指征,但其他各种诊断也可能受益于此技术。
最近的一项研究评估了364名接受OTT治疗的女性,发现95%以上的移植女性卵巢功能得到恢复或增强,表明冷冻过程本身不应该再被认为是实验性的[2]。组织的功能寿命是高度可变的,但取决于OTC时患者的年龄、冻结时卵巢储备的大小和移植组织的数量。然而,值得注意的是,一些女性的卵巢功能持续时间较长(长达10年),而另一些女性的卵巢功能持续时间相对较短,只有1-2年[4]。
目前,据估计,全世界有130多名儿童从OTT受孕[1,2,5]。因此,从冷冻/解冻的卵巢组织恢复生育能力确实是一个发展的领域,这无疑将见证许多进步和新进展。人们很容易联想到试管婴儿技术的引入。自上世纪70年代初至80年代中期出生的第100名试管婴儿以来,出现了大量的新方法和新技术,尽管试管婴儿技术在80年代初的临床突破之前就已经确立了。事实上,在第一个试管婴儿出生后的几十年里,试管婴儿的成功率一直在上升。卵巢组织的冷冻具有相同的潜力。体外受精可能会成为一种广泛使用的技术,主要是因为卵巢的功能单元被储存,而不仅仅是卵母细胞,它可以恢复生育能力和内分泌功能,为组织的新用途提供选择。
1 卵巢组织冷冻的适应症
OTC的目的只有一个:维持卵巢结构和生理功能,适用于不同情况下的多靶点患者。OTC已被证明主要用于保护因使用促性腺激素治疗而面临卵巢功能不全和不孕风险的癌症患者的生育能力[2]。此外,这是青春期前患者保留生育能力的唯一选择,因为在这些情况下,刺激卵巢和收集卵母细胞的方案是不可能的[1]。然而,良性疾病如复发性卵巢囊肿、卵巢扭转、内分泌紊乱和自身免疫性疾病的患者也可能受益于这项有前景的技术[6]。
OTC技术使全世界130多名健康婴儿得以出生[1]。2017年进行的一项荟萃分析显示,在进行自体移植后,重建卵巢活性(63.9%)和自然活产(57.5%)的成功率很高[7]。
然而值得一提的是,由于受教育、职业规划、经济不稳定,甚至在寻找伴侣方面可能遇到的困难,越来越多的女性对推迟首次怀孕产生了兴趣[8]。在过去的35年中,首次怀孕的平均年龄增加了2-4岁,现在已经超过了30岁。由于随着年龄的增长,卵泡的质量和数量都会显著下降,冷冻储存是改善妊娠结局的另一种选择。
OTC也可用于延缓绝经[9]。世界人口预期寿命的增加与更年期妇女人数的增加相结合。在一些欧洲国家,本世纪出生的大多数女孩可能会活到100岁以上,这意味着她们生命中的很大一部分将在绝经后展开[10]。与更年期相关的副作用(骨质疏松、心血管疾病、性功能障碍、抑郁等)会对妇女的健康和生活质量产生巨大影响,这可能会成为一个重大的经济问题。另一种延缓绝经的选择是药物激素替代的处方。然而,药物激素替代可能不适合某些妇女,包括心血管疾病、血栓栓塞性疾病或某些癌症风险增加的妇女。早期的非处方类药物可以保护大量的卵泡,这些卵泡可能会在以后产生女性荷尔蒙,从而延缓更年期的到来。为了避免妊娠风险和降低卵巢组织再植的成本,解冻后的卵巢组织碎片可以异位移植。
2 如何冷冻保存人类卵巢组织
2.1 常规冷冻方法
慢速冷冻法是目前最常用的卵巢组织冷冻保存方法。本程序使用可编程的冷冻机来实现控制的冷冻速度。在任何缓慢的冷冻过程中,冰晶首先在细胞/组织外形成。当水凝固时,外界环境变得高渗。众所周知,快速冷却的速度会阻止细胞内的水离开细胞,导致细胞内的冰晶形成,从而造成细胞损伤。另一方面,缓慢的冷却速率允许渗透调节细胞内和细胞外的液体,但它们可能导致过度脱水和收缩。
在低温保存培养基中加入低温保护剂(CPAs)有助于克服这些问题。CPAs的作用是保护细胞不受冰晶和高渗性的伤害。然而,在冻融过程中,CPAs会对细胞产生渗透作用。当细胞暴露于渗透的CPAs时,它们最初会经历脱水和收缩,然后当CPAs进入细胞时,它们又恢复到原来的体积。这些体积的变化会导致细胞损伤甚至死亡,这取决于它们的速度和大小。添加CPAs也会引起化学毒性对细胞的损伤[11]。最佳暴露的目的应是尽量减少渗透应力,同时避免化学毒性,并允许充分的渗透和脱水,以实现对冻伤的保护。
CPAs分为两类[12]:
(1)渗透剂:甘油,二甲基亚砜DMSO,乙二醇和1,2-丙二醇(PROH);它们的分子量较低,可以通过细胞膜的脂质双层,尽管它们的速度比水慢。
(2)非渗透剂:糖(蔗糖、海藻糖和棉子糖)和大分子(Ficoll和聚乙烯吡咯烷酮),以及蛋白质和脂蛋白;它们仍然存在于细胞外溶液中,因为它们是大分子,有助于促进有控制的细胞脱水。
在大多数卵巢组织的慢速冷冻方案中,使用一种渗透剂和一种非渗透剂的组合。CPA浓度在渗透剂(通常为DMSO)为1.5 M,在非渗透剂(通常为蔗糖)的浓度为0.1 M。
2.2 玻璃化冷冻技术
最近,人类卵巢组织也通过玻璃化冷冻保存[13,14]。玻璃化是将过冷的液体转化成玻璃状的无定形固体,防止冰晶形成的过程。玻璃化过程是基于超快的冷却速度和高浓度CPAs[15]。然而,高浓度的CPAs对细胞有毒性作用。正因为如此,玻璃化方法通常使用两个或两个以上的CPAs的组合,因此,他们的浓度总和支持玻璃化,而每个低浓度的CPA则降低了其毒性作用[16]。理论上,任何渗透的CPA都可以用于玻璃化。然而,乙二醇正被确立为最佳选择,因为它的低毒性和快速扩散到细胞[17,18]。影响玻璃化的另一个因素是样品的体积。样品越小,需要冷却的液体越少,形成冰晶的概率越低。为了实现液体的低体积,使用了不同的冷冻方法,如介质液滴,固体表面,银封闭玻璃化系统,塑料吸管[19]。玻璃化冷冻是一种快速、简便的方法,不需要特别昂贵的设备。虽然这看起来很简单,但如果冷却速度不够快,结晶可能会发生。在成功的玻璃化过程中,组织和周围的溶液变得透明,而失败的玻璃化过程则以不透明的白色样品为特征,这意味着冰晶已经形成。
尽管这种保存方法越来越受欢迎,但仍很少用于卵巢组织保存。与缓慢冷冻不同,卵巢组织没有标准的玻璃化程序。除了日本研究小组报道的2例婴儿外,Kiseleva等人也报道了使用玻璃化卵巢组织的良好结果[13,14,20]。在他们的病例研究中,玻璃化卵巢组织在自体移植后表现出生殖潜能的恢复。
2.3 解冻/升温和再结晶的风险
对于缓慢冻结或玻璃化的组织,在变暖过程中形成冰的风险是一个需要考虑的重要因素。变冷和变暖的速率相互作用,如果仔细考虑两者,就能找到一个合适的结果。脱氮作用是将超浓水转化为结晶冰的过程。再结晶发生在降温过程中形成的小冰晶在升温过程中生长;结果,在先前清晰的样本中出现了不透明的外观[21]。玻璃化体系再结晶的风险更大,因为升温过程比冷却速率的作用更大[22]。在玻璃化过程中,水应直接从液体变成玻璃。然而,在变暖期间,有可能形成冰晶而不是“冰泥”,通过将玻璃转化为一种高粘度的过冷液体。玻璃化体系的升温过程分三个阶段:从玻璃化到超浓化、脱氮(将水转变为冰晶)和再结晶(生长非常小的冰晶)[21]。玻璃化过程中小冰核的形成是不可避免的。然而,如果在升温过程中有足够的时间,就会发生更多的成核和晶体生长,导致组织的形态损伤[23]。为了避免这种情况,必须提高升温速率,并确保适当的CPA浓度。
一旦样品被加热/解冻,注意CPA的去除。在这个步骤中,渗透不平衡可能由于细胞吸收水分而发生,导致细胞肿胀。在玻璃化组织中情况更糟,组织碎片中存在高浓度的CPA。为了避免或最小化这个问题,CPA去除可以缓慢进行。为此,可使用蛋白(人血清白蛋白或血清代用品)或糖(葡萄糖或蔗糖)等溶质,控制CPA的去除。通常,在去除CPA的过程中会使用含有较低CPA浓度的混合溶液。
2.4 OTC的未来趋势
尽管冷冻保存的卵巢组织移植获得了成功的结果,但研究表明冷冻对卵巢基质组织有负面影响,颗粒细胞,膜细胞形成可能参与了大量的空卵泡的形成,这些空卵泡存在于移植的冷冻化的卵巢组织中,影响卵巢组织的功能[24]。这些发现可能是由于冰晶的形成,这是冷冻过程中固有的步骤,也是伤害和细胞死亡的主要来源。为了优化人卵巢组织的冷冻方案,使CPA在卵巢组织样本内分布更加均匀,Corral等人决定对目前慢冷冻过程中的各项参数进行修改[25]。他们更好地证明了这一点DMSO浓度越高,CPA在牛卵巢组织中的通透性和均匀性越好。该方案随后在人类卵巢组织上进行了测试,在20% DMSO浓度的冷冻样品中,由于DMSO浓度较高,形成冰的可能性较小。在短期异种移植后,组织碎片内的CPA含量并没有提高卵巢组织的存活率[26]。尽管如此,较长时间的异种移植最终可能会从这种优化的方案中获益。
几年前,人们对卵巢组织进行了定向冷冻[27]。这一策略允许在不同大小的样品中精确而均匀的冷却速率,这是通过一个热力学原理实现的,在这个热力学原理中,冰晶通过预先设定的温度梯度来控制整个样品的移动速率[28]。这样,当冰晶在与样品运动相反的方向生长时,组织样品正在冷却。该方法成功地实现了全羊卵巢的冷冻保存。尽管有这些有希望的发现,定向冷冻尚未在人类卵巢组织上进行测试。
如前所述,玻璃化已被认为是一种替代慢速冷冻的方法,因为它已被证明可以保存基质组织的超微结构[29]。然而,玻璃化是基于三个关键步骤:添加高CPA浓度和实现高冷却和升温率来降低CPA毒性。为了避免CPA的毒性作用,Corral等人开发了一种名为“分级玻璃化”的程序,即在CPA升高的同时逐步降低温度[30]。它们的策略与平衡玻璃化的不同之处在于CPA毒性随温度的下降和体系熔点的降低不需要遵循相同的曲线。
Manuchehrabadi等人还开发了新的方法来改善低温保存组织的解冻/升温过程,称之为纳米升温技术[31]。纳米颗粒可以悬浮在玻璃化或冷冻溶液中,用于在低温贮藏样品中诱导均匀的升温。这一策略依赖于激光波推动的纳米粒子振荡的概念,激光波在整个样品中产生热耗散,使温度均匀。
3 总结
OTC已越来越多地应用于癌症患者和良性肿瘤妇女的生育能力保护,近年来被认为是健康妇女延缓妊娠和绝经的一种策略。虽然在慢速冷冻过程中有更可靠的结果,世界各地的中心已经开始测试玻璃化方案。尽管如此,优化冷冻保存策略和解冻/升温方案对于提高冷冻保存的卵巢组织中卵泡的存活率是必要的。