2013-2017年中国小反刍兽疫病毒P基因遗传演化特征

盛琰翔，刘春菊，王清华，迟田英，马洪超，王志亮，吴晓东，包静月

（1.浙江农林大学 动物科技学院，浙江 杭州 311300；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032）

小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种急性病毒性传染病，主要感染山羊Caprahircus、绵羊Ovisaries以及其他野生小反刍兽，以发热，眼、鼻分泌物增多，胃炎、腹泻和肺炎为特征。该病主要流行于亚洲和非洲，2007年中国在西藏阿里地区首次发现该病，2010年8月在阿里地区日土县再次发生疫情[1−2]。2013年末，该病传入中国新疆地区，并迅速传播至22个省份，对中国养羊业造成严重危害[3−4]。PPRV属于副黏病毒科Paramyxovirdae麻疹病毒属Morbolivirus；基因组为单股负链RNA，长度为15 948 nt或者15 954 nt；基因组3′末端为前导序列(leader)，5′末端为尾随序列(trailer)；6个基因排列顺序为3′-N-P-M-F-H-L-5′，依次编码6个结构蛋白：核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)和大蛋白(L)；P基因还编码2个非结构蛋白C和V。根据F基因或N基因部分核苷酸序列差异可将PPRV毒株分为4个基因系[5−6]，亚洲国家流行的毒株属于基因Ⅳ系[1]。小反刍兽疫病毒在流行过程中，基因组发生点突变，核苷酸变异速率大约为9×10−4位点·a−1[7−8]。对中国2013年11月至2014年6月间25个毒株的基因组序列的比对和分析发现：P基因变异最大，非同义突变率最高[8]。随着全面免疫的实施，受免疫选择压的作用，病毒各基因尤其是P基因的变异率及非同义突变率发生变化，有必要进一步研究。PPRVP基因核苷酸长度为1 530 nt，编码509个氨基酸，编码的P蛋白分子量约54.9 kD。P蛋白在病毒RNA的转录和复制过程中发挥作用，也能单独与N蛋白-RNA模板复合物结合激活转录，同时与L蛋白相结合形成依赖于RNA的RNA聚合酶，并与N蛋白-RNA模板结合形成核糖核蛋白复合体，进行病毒RNA的转录和复制[9]。本研究对2013年以来中国PPRV流行毒株P基因进行序列测定和分析，探讨病毒流行过程中P基因的序列变异情况。

1 材料与方法

1.1 病毒来源

2014−2017年，采集到9个省12个疫点的PPRV阳性组织样品12份，由中国动物卫生与流行病学中心保存并提供，具体样品信息见表1。

表 1 2014−2017 年中国 12 株 PPRV 毒株信息Table 1 Details of the 12 PPRV strains collected in China during 2014−2017

1.2 病毒 RNA 提取

取肠系淋巴结组织100 mg，用组织匀浆仪匀浆后，根据High Pure Viral RNA Kit (Roche)的操作说明提取病毒RNA，−80 ℃保存备用。

1.3 反转录-聚合酶链式反应 (RT-PCR)

采用Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit (TaKaRa)扩增PPRVP基因。反应体系共50 μL，包括2× 1 Step Buffer 25 μL，Primerscript 1 step Enzyme Mix 2 μL，上、下游引物各 2 μL，病毒 RNA 5 μL。RT-PCR反应条件为：50 ℃逆转录30 min，94 ℃ 2 min，进行Taq酶激活；40个循环的聚合酶链式反应(PCR)(94 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min)；72 ℃ 7 min再延伸。对PCR产物进行切胶回收。

1.4 序列测定和进化树绘制

纯化后的PCR产物送青岛华大公司测序，获得12个毒株的P基因序列；从GenBank中下载2013−2014年中国25个PPRV流行毒株的基因组序列[8](表2)，截取P基因序列后进行核苷酸和氨基酸序列比对。从GenBank中下载中国及其他10个国家共15个PPRV代表毒株的基因组序列(表3)，绘制系统进化树。用MEGA 4.0 软件进行序列比对，用最大似然法构建分子进化树，bootstrap测试1 000次重复。用Simplot软件进行序列同源性分析。

表 2 2013−2014 年中国 PPRV 流行毒株信息Table 2 Details of the PPRV strains collected in China during 2013−2014

表 3 PPRV 参考毒株信息Table 3 Details of the PPRV reference strains used in this study

2 结果与分析

2.1 P基因核苷酸序列比较

2013−2017年，来自中国21个省份37个疫点的37株PPRV毒株P基因核苷酸序列间遗传距离为0～0.009 2。其中，2013年11月至2014年10月间的18个毒株P基因序列完全一致。这些毒株分别来自新 疆 (XJYL2013、XJ22013、XJ32013、XJ42013、XJ52013)、甘 肃 (GS2014)、辽 宁 (LN2014)、重 庆(CQ2014)、云南 (YN2014)、江苏 (JS2014)、湖北 (HB2014)、河南 (HeN2014)、山西 (SX2014)、吉林(JL2014)、贵州 (GZ2014)、湖南 (HN2014)、四川 (SC2014)、浙江 (ZJ82014)等 14个省份。毒株XJ302017与GZ252017间的基因核苷酸序列差异最大，为0.009 2，共14个位点存在序列差异。

为考察毒株序列变异与流行时间的关系，选取最早采集的XJYL2013毒株作为参照，将其余36个毒株与其进行P基因核苷酸序列比对。结果发现：36个毒株分别在0～8个位点发生了突变。其中2013年11月至2014年10月间来自14省份的17个毒株与XJYL2013的P基因核苷酸序列完全一致。2014年3月至2015年3月黑龙江的HLJ2014、江西的JX2014、安徽的AH2014、广西的GX2014和广东的GD2014等5个毒株在不同位点发生了1个变异。2014年2月至2016年8月宁夏的NX2014、陕西的SX2014、吉林的JL2014、江西的JX2014和JX62014、浙江的ZJ2014、广西的GX62016等7个毒株在2个位点发生了变异。2015年4月安徽的AH162015和2016年1月的江苏JS142016等2个毒株在3个位点发生了变异。2015年9月贵州的GZ112015、2016年10月湖南的HN182016、2017年 3月湖南的 HN02017等3个毒株在4个位点发生了变异。2017年9月贵州的GZ252017、2017年2月新疆的XJ302017分别在6和8个位点发生了变异。37个毒株之间的核苷酸变异位点分布于P基因的47个位点，其中45个突变位点仅存在于1个毒株中，2个突变位点分别为3个毒株共有。上述结果表明P基因核苷酸序列突变位点数与毒株流行时间正相关，突变无地域相关性。利用Simplot软件对核苷酸序列发生变异的19株PPRV毒株与XJYL2013进行P基因核苷酸序列同源性比较分析(图1)，结果显示：P基因序列的850～1 250 nt间序列同源性较高，突变分布少，500～800 nt区域变异较大。

P基因的47个核苷酸变异位点中，有26个核苷酸变异导致了氨基酸序列的改变(表4)：17个变异发生于第1位密码子，其中的16个位点导致氨基酸改变；9个变异位于第2位密码子，全部导致氨基酸改变；21个变异位于第3位密码子，1个位点导致氨基酸改变。

图 1 2013−2017年中国PPRV毒株P基因核苷酸序列同源性Simplot分析Figure 1 P gene nucleotide sequence similarity of China 2013−2017 PPRV strains using Simplot analysis

表 4 2013−2017年中国 PPRV 毒株P基因核苷酸和氨基酸序列变异情况Table 4 Nucleotide and amino acid diversity of China 2013−2017 PPRV strains

2.2 P基因氨基酸序列比较

2013−2017年中国37个PPRV毒株P基因氨基酸序列之间的遗传距离为0～0.007 9。P基因编码的509个氨基酸位点中，25个发生了突变，其中氨基端(1～250位氨基酸)16个，羧基端(251～509位氨基酸) 9个(图2)。第21、83、505位氨基酸位点分别有2个、3个和3个毒株发生了变异。在第21位氨基酸位点，XJ302017第1位密码子发生突变，导致丙氨酸(A)突变为苏氨酸(T)，HN182016第2位密码子发生突变，导致丙氨酸(A)突变至缬氨酸(V)。第83位氨基酸位点，3个毒株在同一个核苷酸位点发生不同突变，JL2014和 JX2014导致苯丙氨酸(F)突变至亮氨酸(L)，SaX2014苯丙氨酸(F)突变为缬氨酸(V)。第505位氨基酸位点，3个毒株在同一个核苷酸位点发生相同突变，JX62014、HN182016和GZ112015均发生了亮氨酸(L)至缬氨酸(V)的突变。

2.3 P基因序列差异分析

比较2013−2017年中国37株PPRV流行毒株与之前15株代表毒株的P基因核苷酸序列，发现遗传距离为0.025 4～0.139 7，其中与2007−2008年中国西藏地区3个毒株P基因核苷酸序列遗传距离为0.025 4～0.031 5，而西藏地区3个流行毒株之间的P基因核苷酸序列遗传距离为0～0.001 3。与15株代表毒株的氨基酸序列比对发现：2013−2017年中国37株PPRV流行毒株P基因的10个位点发生了核苷酸序列突变，其中3个导致了氨基酸序列的改变(表4)；2个变异发生于第1位密码子，其中1个导致氨基酸改变；2个变异位于第2位密码子，全部导致氨基酸改变；6个变异位于第3位密码子，未导致氨基酸改变。

图 2 2013−2017年中国37个PPRV毒株P蛋白氨基酸序列比对Figure 2 P protein amino acid sequence alignment of China 2013−2017 PPRV strains

2013−2017年，中国37株PPRV流行毒株与15株代表毒株P基因氨基酸序列的3个变异位点均位于175～243 位氨基酸，全部处在P蛋白的氨基端，其中175和176等2个相邻位点都为变异位点。

2.4 系统发育树构建

基于P基因核苷酸序列构建系统发育树，发现2013−2017年中国37株PPRV流行毒株构成基因Ⅳ系中1个独立的进化小分支，而中国西藏地区流行毒株与印度2014年毒株形成1个小分支(图3)。

图 3 52个PPRV毒株P基因分子进化树Figure 3 Phylogenetic relationships of 52 PPRV genome sequences

3 讨论

本研究对 2013−2017年中国 21个省份37个疫点的PPRV流行毒株P基因进行序列分析，探明了PPRV流行过程中P基因序列变异情况，为PPR控制和消灭策略的制定提供了数据支持。

2013−2017年中国 37个 PPRV流行毒株的P基因变异较大。PPRV在中国流行的4 a间，P基因47个核苷酸位点发生了突变，其中26个导致了氨基酸序列的改变，非同义突变率为55.3%。研究[8]发现：2013年11月至2014年6月，25个毒株P基因在12个位点发生突变，其中10个导致了氨基酸序列的改变，非同义突变率为83.3%，高于F、H、L、N和M基因。已有研究[10]表明：2013−2017年中国37个PPRV流行毒株H基因的非同义突变率为58.5%，高于本研究中的P基因。这一结果提示：实施全面免疫后，PPRV在中国的流行受到了免疫选择压的作用，P基因的非同义突变率降低。

2013−2017年中国流行的PPRV毒株P蛋白氨基酸序列在10个位点发生了特征性的核苷酸突变，其中第21、83和505位3个导致了氨基酸序列改变。已有研究[9]表明：P蛋白对病毒RNA合成至关重要，可以分别与N蛋白、L蛋白及核衣壳结合形成不同的复合体发挥作用。P蛋白与L蛋白结合形成依赖于RNA的RNA聚合酶进行病毒基因组RNA的转录，L蛋白发挥RNA聚合酶(RdRp)的作用，而P蛋白的作用是引导P-L复合体与核衣壳结合。一旦获得足够多的病毒蛋白，N蛋白就与病毒RNA结合，在这个过程中，P蛋白发挥蛋白伴侣的作用，引导N蛋白以游离形式与RNA结合。通常认为[9]：N-P复合体调节从转录到复制的转变。P-L复合体负责病毒基因组的复制，也就是说，先合成全长正链反向基因组RNA，然后以其为模板合成负链基因组RNA，用以组装病毒粒子[11]。P蛋白通过与游离的N蛋白结合，从而阻止N蛋白发生非特异性的自我组装，形成的N0-P复合物在复制过程中对新合成的RNA进行加帽化。副粘病毒 P蛋白C末端的X-domain是主要的 N蛋白结合位点[9]。PPRV第429～509位氨基酸区域高度保守，推测可能为N蛋白结合位点[12]。P蛋白与其他蛋白相互作用的功能域主要分布于羧基端，因此，在病毒演化过程中，P蛋白的羧基端较为保守。本研究发现：2013−2017年中国流行的PPRV毒株P蛋白氨基酸序列在505位发生了高频突变。该突变对其结构及功能的影响还需要进一步的研究。

在中国流行过程中，PPRV毒株P基因突变位点的数量与毒株流行时间呈正相关。本研究发现：相对于最早分离的XJYL2013，2013−2014年流行的毒株P基因突变位点为0～2个，而2017年流行毒株P基因突变位点为4～8个，随着毒株流行时间增长，P基因突变位点增多。已有研究[8]表明：PPRV毒株基因组在流行过程中的核苷酸突变进化速率为9.54×10−4位点·a−1。在流行过程中PPRV毒株P基因持续发生突变，但不同毒株突变位点不同，表现为相对随机的突变。随着流行时间的增长，在稳定免疫选择压的作用下，是否会出现变异位点的稳定和定植，还有待进一步的研究。持续实时监测PPRV各基因分子变异，对于该病的防控具有重要意义。