复发性流产和反复移植失败的免疫治疗

柴瑞凡，何玉洁

0 引言

复发性流产(Recurrent spontaneous abortion，RSA)是指同一对性伴侣连续发生3次或3次以上在妊娠28周之前的胎儿丢失，在有生育能力的夫妇中发病率高达1%～5%；RSA中有50%以上属于不明原因的复发性流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion，uRSA)[1]。在辅助生殖技术(Assisted reproductive technology，ART)中，约10%的不孕患者在体外受精(Invitrofertilization，IVF)后至少有2～3次种植失败。反复种植失败(Recurrent implantation failure，RIF)是指40岁以下的女性在至少3个新鲜或冷冻周期内移植至少4个优质胚胎后未能实现临床妊娠[2]。大量研究发现uRSA与RIF的发生与免疫相关，如某些抗体的异常升高、各种细胞因子异常表达以及细胞免疫异常等。这些免疫异常可能导致母-胎免疫耐受异常，进一步影响胚胎着床及发育，从而导致流产。临床上对于uRSA及RIF的治疗可选择免疫治疗，本文将从uRSA与RIF的免疫治疗机制及临床进展进行阐述。

1 糖皮质激素

糖皮质激素因其强大的抗炎和免疫抑制特性成为uRSA和RIF免疫治疗的首选药物，目前临床上应用较广的主要是泼尼松，且较少单独使用，临床上多数研究为泼尼松与阿司匹林、肝素、孕酮、复合维生素等联合使用，可改善妊娠结局[3-6]。泼尼松可诱导淋巴细胞向妊娠所需的Treg细胞分化，抑制其向对妊娠有害的Th17细胞分化，抑制IL-17 mRNA的表达和IL-17的分泌，促进Foxp3 mRNA表达、IL-10分泌[4]。在免疫过度激活的患者中，泼尼松可下调IL-18/肿瘤坏死因子样弱凋亡的诱导物(Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)及IL-15/Fn-14(Fibroblast growth factor-inducible molecule，纤维细胞生长因子诱导分子)比率[5]，从而改善免疫过度激活状态，阻止形成不利于着床的Th1主导的微环境、改变子宫自然杀伤细胞(Uterine natural killer cell，uNK cell)的局部细胞毒性，促进血管生成及免疫营养通路的构建[5-6]，从而提高妊娠率。

2 宫腔内注射自体外周血单个核细胞

外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)提取于自体外周血，主要由单核巨噬细胞(10%～30%)、淋巴细胞(70%～90%)、树突状细胞(1%～2%)和其他几种类型细胞组成。此疗法改善胚胎移植后妊娠结局的机制可能为：①PBMCs可增强滋养细胞的增殖活性，利于胚胎着床；②这些细胞分泌的细胞因子和生长因子，如白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-8(IL-8)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)及各种蛋白酶等改善了宫腔内的免疫环境；③人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，hCG)可增强PBMCs的作用[7-10]。在动物实验中，宫腔内注射PBMCs可改善小鼠、牛等的子宫内膜容受性，从而提高胚胎移植后的妊娠率[7]。在IVF-ET失败患者中，宫内给予hCG激活的PBMC可提高着床率及妊娠率[8-10]，且强调在RIF患者(至少3次胚胎移植失败的患者)中更显著[9]。多数研究认为，hCG体外孵育PBMC的最佳时间为24 h，因为此时细胞产生的各种细胞因子等含量最高；也有研究将孵育时间控制为48 h，或更方便新鲜PBMCs的移植[8-10]。最早进行hCG激活的PBMCs宫内给药的研究发表在2006年，为新鲜取卵周期进行，宫腔内注射的细胞混悬液为取卵当天从患者本人外周血提取、经hCG孵育48 h后的PBMCs与取卵后2 d再次提取的新鲜PBMCs的混合物，给药时间为取卵后第2天，囊胚移植时间为给药后第3天[8]。自此，关于解冻周期中宫内注射PBMCs的研究逐渐增加，在卵裂早期胚胎解冻周期中，宫腔内注射PBMCs的时间一般为该周期第1天，在囊胚解冻周期中一般为该周期的第二天，而在囊胚解冻移植周期中给予宫腔内注射hCG激活的PBMCs，可能因数据较少，着床率和妊娠率未见明显改善[9]。

3 粒细胞集落刺激因子

粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是由骨髓细胞、成纤维细胞、基质细胞、内皮细胞及免疫活性细胞如T细胞、单核巨噬细胞等产生的，影响造血祖细胞生存、生长和分化所必需的一类生长因子，可调节成熟免疫细胞的功能，促进血管生成[11-14]。随机对照试验结果显示，G-CSF可提高RSA和RIF患者的临床妊娠率和活产率，在改善薄型子宫内膜厚度方面有一定作用，但对提高着床率、妊娠率及活产率无明显作用或无作用，这可能与纳入标准偏差和样本量不足有关[11-13]。G-CSF对胚胎植入过程的调节及对妊娠结局改善的机制可能是通过对免疫细胞功能的调节产生的，如增加蜕膜组织中Treg细胞数量及利于胚胎着床的细胞因子如G-CSF和VEGF等的含量，也可能与促进子宫内膜细胞再生、增加子宫内膜厚度、改善子宫内膜容受性有关[11]。G-CSF的给药方式目前主要有口服给药、宫腔内注射及皮下注射，针对接受新鲜移植周期治疗的RIF患者。目前关于促性腺激素释放激素(Gonadotropin Releasing Hormone，GnRH)激动剂方案中宫腔内注射G-CSF的研究较多，给药时间多为扳机日注射hCG之前，剂量多为300 μg[12-13]。在冷冻胚胎移植(Frozen embryo transfer，FET)周期中，给药时间为FET周期的第14天，剂量为300 μg[14]。对于RSA患者则可采用口服给药，有研究在排卵后第6天开始口服G-CSF[1 mg/(kg>·d)]，至月经来潮或妊娠第9周末。

4 免疫球蛋白

免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)提取自大量健康献血者的混合血浆，含有可广泛针对外来抗原的抗体和自体抗原[15-18]。已有研究证明,静脉注射用人免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin，IVIg)可以改善RSA患者的妊娠结局，相较于异体白细胞疗法可避免感染及HLA免疫的传播风险，且效果相近，推测其机制为IVIg含有可保护胎儿免受免疫排斥反应的特异性抗体。关于IVIg治疗uRSA和RIF机制的讨论尚未达成一致。有研究证明，hCG联合IVIg治疗可降低Th17及其细胞因子IL-17、IL-6水平，而提高Treg细胞水平及相关细胞因子IL-10和TGF-β水平，即改善Th17/Treg比值，利于维持妊娠[15]。也有研究显示，IVIg治疗可降低CD4+T细胞比例，恢复Th1/Th2细胞因子平衡，维持Th2型细胞因子占主导的利于妊娠的环境。对于卵泡早期外周血CD56+、CD16+及NK细胞百分率低的RIF患者，IVIg治疗可显著提高胚胎种植率和妊娠率[16]。此外，IVIg联合泼尼松治疗应用于uRSA和RIF较IVIg单药治疗可能活产率更高[18]。多数研究建议，IVIg仅适用于有异常细胞免疫患者，而异常细胞免疫的标准因检测方法等的差异未形成共识[15-18]。关于IVIg的使用剂量和频率，各研究尚无统一标准。对于RSA患者，目前的治疗方案多为妊娠4～7周期间给药(20 g，iv，5 d)。对于RIF患者，不同研究的给药方案不同，有针对长效GnRH激动剂方案控制性超促排卵的研究，于FSH刺激周期第8天开始第1次给药(24 g，iv)，经血hCG检测及超声确定宫内妊娠后，于妊娠第4周、第6周及第10周分别再次给药(24 g，iv)；也有研究采用移植前5 d到移植后1 d给药(25 g，iv，7 d)，检测血hCG阳性后立即再次给药(25 g，iv)，待B超确定宫内妊娠后于孕5～9周每周1次给药(25 g，iv)，孕10～14周每2周1次给药(25 g，iv)[15-18]。

5 环孢素A

环孢素A (Cyclosporin A，CsA)是一种广泛应用于器官移植和自身免疫性疾病的强效免疫抑制剂，可以防止宿主对同种异体移植物的排斥反应，属于钙调磷酸酶抑制剂。动物实验及体外研究结果表明，低剂量CsA能以浓度和时间依赖性的方式促进妊娠早期滋养细胞的增殖，并促进妊娠早期滋养细胞的迁移与侵袭能力。此外，其在诱导母-胎界面免疫耐受、调节免疫细胞功能方面有重要作用，从而导致妊娠结局的改善[19]。同时有临床试验结果支持适当剂量的CsA治疗RSA及RIF疗效好，可获得良好的妊娠结局[20]。关于CsA改善妊娠结局的作用机制，目前有研究支持其可调节Th1/Th2型细胞因子比例平衡，促进形成Th2型细胞因子占主导的利于妊娠的母胎免疫界面。也有研究表明，CsA可促使外周血CD4+CD25+FOXP3+T细胞增殖并分泌相关细胞因子、调节外周血NK细胞的数量及功能，增强滋养细胞侵袭能力，促进胚胎植入。亦有研究发现，CsA改善RSA及RIF患者妊娠结局可能与巨噬细胞、树突状细胞等的抗原提呈功能的改善有关[20-21]。动物实验发现，CsA的血药浓度维持在0.1～1.0 μmol/L时效果最好，而在临床上，给药方法为孕前30～60 d口服CsA 50 mg(bid或tid，根据体重选择)，使血药浓度维持在80～150 ng/ml，用药时间为4周[20]。关于CsA的不良反应，有动物实验发现，CsA对大鼠及家兔有生殖毒性，可能会增加早产风险，但大多临床试验研究尚未发现明显毒副作用，这可能与样本数量少有关[19-21]。

6 羟氯喹

羟氯喹(Hydroxychloroquine，HCQ)最早作为一种合成抗疟药物于20世纪40年代问世，20世纪50年代被应用于系统性红斑狼疮，70年代被广泛用于骨科术后预防血栓治疗，目前作为治疗风湿免疫性疾病的基础药物被广泛用于临床。此外，其在治疗皮肤病、感染性疾病(抗疟原虫、细菌、病毒等)、内分泌疾病、心血管疾病及肿瘤等领域发挥重要作用。有研究发现，HCQ应用于系统性红斑狼疮患者及抗磷脂抗体阳性患者可改善其妊娠结局，并发现HCQ可剂量依赖性地降低血栓形成风险、血管内皮功能障碍等[22-25]。此外，HCQ在抗炎及免疫调节方面也有潜在的影响，关于免疫调节机制，目前有研究认为，其可通过抑制某些Toll样受体的激活对免疫产生影响。也有研究发现，HCQ可通过减少循环中IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ等Th1型细胞因子的含量，促进Th1/Th2型细胞因子比例平衡[23-25]，但关于HCQ对于RSA和RIF患者免疫调节机制的研究较少，尚无法讨论。目前临床上认为HCQ对改善RSA和RIF患者妊娠结局有潜在意义，相关临床研究正在进行或将进行。HCQ的不良反应与每日的最大剂量相关，安全剂量为低于6.5 mg/(kg>·d)，在上述试验中于孕前给药，每日剂量为400 mg/d，至妊娠10周或未妊娠者1年停药[24-25]。

7 大环内酯类免疫抑制剂

本文主要介绍他克莫司(FK506)和西罗莫司(又称雷帕霉素)，两者结构相似，均具有抗菌、免疫抑制和抗肿瘤的作用，但用于临床时间尚短。他克莫司的免疫抑制作用机制主要是通过抑制钙调蛋白依赖的蛋白磷酸酶的活性，从而抑制核调蛋白、T细胞活化因子(如IL-2)的分泌及细胞因子相应受体的表达，体外试验中能有效抑制混合淋巴细胞反应，目前多作为器官移植后的免疫抑制剂，且有研究认为其免疫抑制作用强于环孢素而不良反应小于环孢素[26]。西罗莫司通过抑制雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamacin，mTOR)的活性发挥作用，可阻断T细胞及B细胞的钙依赖和非钙依赖的信号传导通路，通过作用于不同细胞因子受体阻断信号传导，减少INF-γ、TNF-α、IL-6等细胞因子的分泌，同时促进IL-10等的分泌，目前常用作器官移植后的免疫抑制剂，其抗排斥疗效好、低毒、无肾毒性，也作为抗癌药物和治疗阿尔茨海默症的新型药物[27]。鉴于两种新型免疫抑制剂的作用机制与RSA及RIF可能原因的重合，推测其对RSA及RIF患者是否有益。动物实验证明，西罗莫司可改善低Treg细胞的小鼠的胚胎种植率，提示西罗莫司可能对改善Treg细胞异常的RSA及RIF患者的胚胎种植率及妊娠结局有益，但仍缺乏相关研究证实。关于其对母胎的安全性，有动物实验发现其对实验动物有生殖毒性。也有研究发现，肝移植后使用他克莫司的患者发生妊娠不良事件如子痫前期、早产等的风险可能增加，但因样本数量较少，尚不能定论[28-29]，而关于西罗莫司的动物实验未发现明显母胎不良反应，但仍需更多数据说明。

8 丹酚酸B

丹酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)是提取于丹参的一种水溶性成分，已有大量研究证明其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及免疫调节功能，在心脏保护、脑血管保护、抗肝纤维化及抗肿瘤等方面有着广泛作用[30-32]。有研究发现，Sal B可增加VEGF的表达，促进血管新生。也有动物实验发现，其可改善自然流产模型小鼠的妊娠结局，减少外周血CD8+T细胞及NK细胞的数量，降低胎盘促炎因子如TNF-α、INF-γ、IL-6的分泌及Toll样受体的表达，从而调节母胎界面免疫平衡，改善妊娠结局[33]。

9 免疫治疗的安全性

关于免疫治疗的安全性，我们主要从妊娠期母体的耐受能力、药物对母体的毒性及其致畸、流产、对胎盘功能的影响和远期对胎儿的不良影响等方面进行评价。根据糖皮质激素的药理作用，推测其可能导致或加重患者水钠潴留、骨质疏松、妊娠期糖尿病等。有动物实验证明，糖皮质激素可增加胚胎腭裂、胎盘功能不全、胚胎发育迟缓的发生。也有研究发现，在大剂量糖皮质激素或冲击疗法治疗妊娠合并风湿免疫系统疾病时，可能增加妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病、感染及胎膜早破的发生率。因泼尼松通过胎盘可失活、对胚胎影响较小，常作为RSA及RIF患者首选的糖皮质激素治疗药物，有临床资料显示，小剂量(≤10 mg/d)泼尼松应用于系统性红斑狼疮等风湿免疫系统疾病或肾移植的妊娠患者未发现致畸作用。临床上RSA及RIF患者多于备孕期及妊娠早期短期使用泼尼松，因此，其对婴幼儿的生长发育未见不良影响[4-7]。G-CSF对母体潜在的不良反应有骨痛症、发热、过敏反应及Sweet综合征(一种炎性疾病，以发热、中性粒细胞增高伴皮肤多发性、痛性红斑样结节及皮内大量中性粒细胞浸润为特点)，但其发生率低。大量研究显示，其应用于RSA及RIF患者未发生明显不良反应，而其对胎盘及胎儿的影响尚缺乏研究资料[12-15]。IVIg的不良反应多与输注速度及使用剂量相关，一般低剂量很少发生，关于其不良反应发生率的报道差异很大，常见症状有背痛、头痛、胸痛、畏寒、发热、心悸、恶心、呕吐、腹泻等，此外还有肾脏毒性、血栓形成、过敏反应、无菌性脑膜炎、中性粒细胞减少症、溶血、输血相关急性肺损伤及病毒传播性疾病等。关于RSA及RIF患者的IVIg治疗的研究多使用小剂量、慢速输注，可能因此尚无严重不良反应的报道[16-19]。对于环孢素A、羟氯喹及大环内酯类免疫抑制剂，均有动物实验证明其有生殖毒性，且有潜在致畸风险[20,22,28]，但作为治疗风湿免疫系统疾病的常用药物，较多研究支持合理剂量对胎儿没有严重危害，未发现致畸作用，该结论可能与缺乏可靠的人群资料有关。

10 结语

综上所述，目前关于改善RSA及RIF患者妊娠结局的免疫治疗的研究较多，且证实有效、临床已采用的方法已为这些患者带来福音，更有新型免疫抑制剂可能有更好的效果及更小的伤害，但仍需更多的研究来进一步证实，并探究更有效更安全的用法、剂量。这提示我们关于RSA及RIF的免疫机制的研究、免疫抑制剂应用于RSA及RIF患者的研究有着无限的未知空间。