MicroRNAs 与中枢神经系统退行性疾病相关的研究进展

江张胜，田丽伟，赵晨玲，董 婷

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）、亨廷顿舞蹈病（Huntington’s Disease，HD）和肌萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）等中枢神经系统退行性疾病，被认为是危害较大的神经系统疾病，已成为世界性卫生保健难题［1-2］.上述中枢神经系统退行性疾病目前尚不能完全治愈，仅可通过药物改善其症状.因此，需要深入研究AD、PD、HD、ALS 4 种疾病的发病机制，以提高其临床诊治效果.miRNAs 参与神经元的早期分化和发育且影响神经元的功能，miRNAs 的失调在中枢神经系统退行性疾病［3］的发病机制中至关重要.为了更好地理解miRNAs 在中枢神经系统退行性中作用的分子机制，本文从miRNAs、miRNAs 与中枢神经系统退行性疾病的关系进行论述，力求为临床防治中枢神经系统退行性疾病奠定理论基础.

1 miRNAs 概述

1.1 miRNAs 的生物合成特点

miRNA 是长度为20～24 个核糖核苷酸的内源性非编码单链RNA 分子，是重要生物过程中已知调控因子，在介导RNA 的剪切或翻译抑制中发挥着重要的调控作用.miRNA 基因通常被RNA 聚合酶II 转录为原始RNA，通过核糖核酸外切酶III 剪切成发簪状的前体miRNA（pre-miRNA），然后通过输出蛋白Ⅴ［4］输出到细胞质中.在细胞质中，pre-miRNA 被核糖核酸内切酶切割成miRNA 双链，其中一条链被载入RNA 诱导沉默复合体（RISC）中的Argonaute（AGO）蛋白中，并作为与蛋白编码RNA（mRNA）结合的引导序列与靶基因mRNA 的3’非翻译区（3’UTR）碱基的互补配对发挥其沉默靶基因的表达作用［5］.

研究表明，超过60%的人类基因是由miRNAs调控的，miRNAs 被证明大多数存在于脑组织、脑脊液和血清中.从脑组织活检中收集到miRNAs 的表达可以反映脑细胞外间隙液的组成，并作为疾病的非侵入性生物标记物［6］.

1.2 miRNAs 的作用机制

研究表明，miRNAs 的典型作用机制是基于序列互补性与3’UTR 的相互作用.最近的研究表明，miRNAs 的作用机制多种多样，包括与5’非编码区相结合对功能产生影响［7］.其具体的作用机制是miRNAs 与其靶基因之间的相互作用通过影响mRNAs 的稳定性或影响蛋白质翻译而改变蛋白质输出.重要的是，miRNAs 与其靶mRNAs 之间的绝对序列互补不是必要的；这种灵活性意味着每个miRNA都可以结合和调控大量的mRNAs.因此，转录抑制会对靶基因进行调节，通常是同一个靶基因会结合多个miRNAs 协同作用.这些调控主要依赖于miRNAs 的核心机制和信号转导之间的相互作用，以应对外部或内部刺激，并动态塑造miRNAs 的产生程度，以维持特定的生理或者病理生理条件下稳健的基因表达.

1.3 miRNAs 的特点和检测

miRNAs 是稳定的，能够抵抗内源性RNAs活性的降解.它们能够承受恶劣的环境条件，如极端pH 值水平、长期储存和多种不同类型体液中的多次冻融循环［8］.此外，可以使用不同的生物学技术，如二代测序（NGS）、定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和微阵列分析等，对miRNAs 进行定量检测.目前应用最广泛的方法是qRT-PCR，因为它操作简单、灵敏度高，能够检测较低水平的miRNAs，但只能应用于有限数量的miRNAs.NGS 允许对整体miRNAs 的表达水平进行定量分析，包括低丰度的miRNAs.此外，它还可以用来检测新的miRNAs，但NGS 明显比其他方法昂贵许多.因此，它可能被用来探索疾病特异性miRNAs 指纹图谱，但目前还不适合用于临床诊断［9］.微阵列分析能够检测约2 000 种选定的miRNAs，分析需要更大数量的RNA，且重现性较低，存在交叉杂交的问题［10］.对于所有的方法，人们希望从样本中提取出所有miRNAs，是具有挑战性的.因为与蛋白质等相比，体液中的miRNAs 浓度相对较低，再加上目前缺乏常规化、标准化的方法，导致miRNAs 仍处于初期阶段，无法成为广泛使用的生物标志物.

2 miRNAs 作为中枢神经系统疾病的潜在生物标志物

miRNAs 有可能被用于中枢神经系统的早期准确诊断，这有利于患者获得更早和更个性化的靶向治疗.尽管miRNAs 作为疾病新的生物标志物潜在价值的研究数量显著上升，但是关于miRNAs 与中枢神经系统疾病之间关系的认识仍然存在着很大的差距.中枢神经系统的生物标志物的发现由于涉及脑的作用机制、脑组织的难以获取、复杂的神经解剖和大脑的功能而滞后.此外，还跟环境与基因的相互作用、中枢神经系统的特异性、人群样本分层等不同的作用因素有关.本文主要综述4 种中枢神经系统退行性疾病，即AD、PD、HD、ALS，这些疾病均与认知障碍有关.研究了不同疾病内部和不同疾病之间miRNAs 失调的异同，对miRNAs 作为脑病理中枢神经系统疾病生物标志物的潜在价值进行综合评估.

3 中枢神经系统退行性疾病特异性生物标志物

3.1 miRNAs 与AD

AD 是一种不可逆的、进行性的大脑紊乱、伴随记忆和思维能力减退的中枢神经系统退行性疾病.AD 早期的主要病理特征是患者脑脊液中β 淀粉样蛋白水平的下降、磷酸化tau 蛋白以及总tau 蛋白水平升高［11］，AD 的发病还与凋亡、炎症、细胞周期异常等多种因素 密 切 相 关［12］.miRNAs 参 与 并 调 控AD 的 病理过程，如对CREB/LAK2/STAT3 信号通路的调控作用，参与tau 蛋白磷酸化和神经细胞凋亡等过程，β 淀粉样蛋白代谢和炎症、凋亡等基因都很有可能作为miRNAs 作用的靶点.

大量的人和动物实验研究表明，异常的大脑miRNAs 靶向mRNAs 表达可能参与了AD的发 生［13-14］.在海 马体 中，KOCERHA［15］等发现miR-9、miR-125 和miR-128 被持续地改变.在AD 的早期阶段，miR-9 的变化在大脑皮层和海马区明显，这与β 淀粉样斑块形成和神经退行性变相对应.然而，小脑在疾病的后期会表现出淀粉样蛋白积累和神经元萎缩的现象.miR-29 家族的缺失可能会导致淀粉样蛋白裂解酶1 蛋白（BACE1）/β 淀粉样蛋白酶水平的增加，导致散发性AD 的发生.同样，大脑中miR-107 的下调，上调BACE1 mRNAs 水平与AD 的发生有关［16］.

KEMPF 等［17］报 道，miR-132 的 变 化 主 要发生在显示tau 过磷酸化的神经元中，而miR-212 主要在非神经元细胞中表达.在大脑的许多区域，包括海马体、前额叶和颞叶皮层、颞叶和额叶内侧回以及小脑，它们都被下调.胼胝体也是与记忆形成相关的大脑区域.MARTIN 等［18］强调，胼胝体中miR-146 的增加不仅与AD 有关，还与癫痫和多发性硬化有关.颞区miR-501-3p 的上调脑皮质可导致AD［14］患者死后脑血管损伤和血脑屏障破坏.血液miRNA 变化是AD 理想的诊断生物标志物［19-20］.在一项大型研究中，GUO 等［21］报道了血清中的miRNAs（miR-26a-5p、miR-181c-3p、miR-126-5p、miR-22-3p、miR-148b-5p、miR-106b-3p）标志物作为AD 早期诊断的无创生物标志物.MÜLLER 等［22］发现，在脑脊液中，miR-29a 作为生物标志物诊断AD 的敏感性为89%，特异性为70%.miR-139 通过调控大麻素受体2（CB2）介导的神经炎性过程参与AD 的发病，miR-139 通过下调CB2 的表达促进神经炎性反应.

综上所述，深入研究miRNAs 在AD 发病机制中的作用有利于为AD 的诊断提供新的生物标志物，为临床靶向治疗AD 提供更大的帮助.

3.2 miRNAs 与PD

PD 是老年人最常见的中枢神经系统退行性疾病，涉及大脑多巴胺能神经元进行性丢失，表现为运动功能障碍和静息性震颤、运动迟缓、僵直、姿势不稳、认知障碍等临床症状［23］.目前，PD 的临床治疗主要以症状性治疗为主，包括儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）抑制剂、单胺氧化酶B 抑制剂等药物治疗，以及深部脑刺激等非药物干预［24］.虽然这些治疗可以缓解帕金森病的运动症状，但它们在本质上并不能起到神经保护作用，也不能阻止疾病进展或逆转神经退行性变.因此，许多人致力于了解PD 的发病机制，以发展神经保护治疗.

最近，miRNAs 被发现受到PD 风险基因的调控，并很有可能通过对线粒体和免疫途径直接调控PD 的发生.研究表明，miR-29 可调节PD 发展的各种重要过程，如细胞凋亡和神经元存活、细胞衰老、运动功能调节、免疫调节［25-26］.此外，ROSHAN 等证明，在小鼠大脑中抑制miR-29 会导致大量细胞死亡，尤其是海马和小脑细胞死亡，这些小鼠还表现出共济失调的特征，如步长缩短，这表明miR-29 在运动协调中的作用［27］.miR-29b 通过靶向促凋亡bh3 家族的基因来抑制细胞凋亡，从而促进神经元存活.CHOI 等［28］发现miR-7 在PD 患者中的黑质多巴胺能神经元中广泛表达，并且通过体外实验发现miR-7 可以促进SH-SY5Y细胞的糖酵解，使其产生更多的ATP 以满足神经元活动能量的需求，可以有效地减少多巴胺能神经元的变性坏死.LI 等［29］发现miR-221 通过靶向作用PTEN 来调节PC12 细胞活力和凋亡，从而在PD 中起保护作用.韩凯［30］发现外周血清miR-103a、miR-30b 和miR-29a相对表达量，可以用于PD 早期诊断的无创新型标志物.ZHANG 等［31］利用逆转录定量PCR方法对46 例散发性帕金森病和49 例正常对照组血浆中miRNAs 的水平进行检测，结果发现PD 患者的循环miR133b 和miR-433 表达水平较正常对照组明显降低，miR133b 和miR-433 在对照组和PD 组中均呈现很强的相关性.表明miR133b 和miR-433 可能作为PD 的潜在生物标志物.

综上所述，深入研究miRNAs 在PD 中的表达异常有利于为PD 的诊断提供新型生物标志物，为临床进一步对PD 的早期诊断和治疗提供新的思路和手段.

3.3 miRNAs 与HD

HD 是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病，其特征是进行性运动、行为和认知能力下降.HD 患者的病变是由染色体4 号上杭丁顿基因（HTT）的三核苷酸重复扩增，该基因产物HTT 蛋白在人类神经元中广泛表达，具有多种功能.在一般人群中，HTT 基因中 平 均 有17～20 个CAG 重 复.CAG 重 复40 次以上，HD 的外显率为100%，临床表现的症状越重.miRNAs 是一种功能性小的非编码RNA，也受到突变HTT 蛋白的影响.

研究发现，miR-128a、miR-34a 在HD 模型小鼠中表达降低.miR-128a 调控包括HTT 和Huntington 相互作用蛋白Ⅰ在内的HD 典型信号 基 因.KOCERHA 等［15］研究 表明，miR-128a脑中的表达水平在HD 病人的临床表现出现前后均有下调的趋势，提示miR-128a 参与HD的 发 病过程.HOSS 等［32］鉴 定 了HD 患者 的 脑中有75 个miRNAs 差异表达，存在5 个miRNAs（miR-10b-5p、 miR-196a-5p、 miR-196b-5p、miR-10b-3p 和miR-106a-5p）被确认与CAG 长度调整发病年龄有显著关系，其中包括HD 病例中最强烈过表达的miR-10b-5p.尽管在这些研究中，前额皮质是组织轮廓的来源，但miR-10b-5p 表达与纹状体参与疾病的关系独立于皮质参与.miR-124-3p 主要在中枢神经系统中表达，在HD 的动物模型中，过表达可以导致症状恢复［33］.功能上，miR-124-3p 参与了凋亡信号、自噬、神经发生、谷氨酸信号和免疫调节.在这些动物模型中过表达miR-124-3p 似乎可以调节这些功能，从而限制或预防疾病的发生.

综上所述，深入研究miRNAs 表达的差异性有利于了解miRNAs 参与HD 相关靶基因的调控，为临床靶向治疗HD 提供了一个新的手段.

3.4 miRNAs 与ALS

ALS 是一种以运动皮层、脑干和脊髓的选择性运动神经元变性为特征导致全身进行性肌无力和肌萎缩，最终会导致呼吸麻痹致死［34］的中枢神经系统退行性疾病.目前，关于ALS 具体的发病机制并不是十分明确.可能与Cu/Zn 超氧化物歧化酶（SOD1）基因突变、免疫炎性反应、星形胶质细胞功能异常有一定的相关性.miRNAs 能结合互补的靶序列并调节基因表达，它们是建立神经表型和中枢神经系统退行性变的关键分子.因此，特异性的生物标志物可以帮助疾病早期发现和诊断，也可以作为疾病进展和治疗效果的指标.

MARCUZZO 等［35］研究发现ALS 转基因鼠模型在晚期阶段全脑中miR-9、miR-124a、miR-19a/19b 的表达较正常同龄对照组明显升高.这些miRNAs 随后在18 周的ALS 小鼠与同年龄对照组的人工解剖的脑室下区、海马体、初级运动皮层和脑干运动核中进行分析.在脑室下区和海马区，miR-124a 表达上调，miR-219 表达下调，神经干细胞和祖细胞数量也显著增加.在ALS 转基因鼠脑干运动核和原代运动皮层中，miR-9 和miR-124a 显著上调，miR-125b 表达升高.KLATT 等［36］发现，在ALS小鼠模型中，各组织中凋亡介质的上调/下调与miR-29b-3p 的表达水平有关.在ALS 小鼠模型的小脑中，miR-29b-3p 的表达水平显著增高，使促凋亡因子BMF、Bcl-2、Bax 和Bak1的表达下调，活化Caspase3 从而保护神经功能.miR-29 对正常的运动功能是必要的，miR-29a/b 丧失了会引起严重的运动障碍［37］.在脊髓中，miR-29b-3p 的表达量有所下降，对促凋亡因子的抑制作用明显减弱，导致细胞凋亡，从而引起神经变性.因此miR-29b 的异常表达水平在ALS 的病因、发病机制中可能会起十分重要的作用，同时miR-29b 表达水平的特异性很有可能会成为ALS 早期的检测标准和治疗靶点.

综上所述，miRNAs 与ALS 的发病机制密切相关，因此深入研究ALS 的发病机制对临床靶向治疗ALS 有十分重要的意义.

4 miRNAs 参与多种中枢神经系统疾病

大量的研究已经表明miR-29 家族和miR-132-3p 在2 种或2 种以上中枢神经系统退行性疾病中存在着异常的调控作用，这些miRNAs 似乎在导致认知缺陷的途径中发挥了核心作用.下面对相关miRNAs作一简要阐述.

4.1 miR-29 家族

miR-29 家族似乎在AD、PD、HD 等中枢神经系统退行性疾病中发挥着主导的作用，该家族的调控基因包括的miRNAs 分别是miR-29b-1、miR-29b-2 和miR-29c，分别是从人类基因组的1 号染色体和7 号染色体转录而来的［38］.miR-29b-1 和miR-29b-2 具 有相 同的 成熟序列，而miR-29a 和miR-29c 只存在一个核苷酸差异.研究表明，miR-29 家族与神经元的存活、成熟增殖、可塑性、树突状棘和突触形态相关［38］.

BAI［38］等 表明，PD 患 者的血 清中miR-29家族均呈现下降的趋势.但有趣的是，与miR-29b 相 比，PD 患 者 中miR-29a 和miR-29c的下降水平较大.因此有人指出在人类基因组中，miR-29b 的复制可能与其家族的其他miRNAs 相比有不同的方式影响其表达.血清中的miR-29a 和miR-29c 的表达水平与PD 的患病的严重程度呈负相关，但与疾病的患病持续时间无关.同时，女性血清miR-29a 和miR-29c 表达水平程度明显高于男性对照组和PD 患者.众所周知，PD 患者的男性患病率明显高于女性.经过性别分层分析后发现，miR-29 的 差 异 主 要 是 在 男 性PD 患 者 中［39］，共同表明PD 中的miR-29 家族呈现特异性的表达水平.因此，有必要进一步研究miR-29家族在PD 患者的生理病理和发病中的作用，发现PD 患者的发病机制与miR-29 家族特异性调控之间存在的关联性.虽然BAI 提出血清中miR-29 家族表达水平的失调是PD 患者的特异性表现形式，但也有许多的研究表明AD 患者中miR-29c 表达水平会出现失调，miR-29a 和miR-29b 与BACE1 有一定的关联性，促 进AD 病 理 的 生 成［40］.且miR-29a 和miR-29b 水平的降低与脑的丝氨酸棕榈酰转移酶和β 淀粉样蛋白水平升高相关，这表明丝氨酸棕榈酰转移酶和miR-29 调控因子通过神经酰胺的产生在AD 患者中发挥重要的作用［41］.

4.2 miR-132-3p

AD、PD、HD 和ALS 中神经元的可塑性及相关 通路被证明调节异常［42］.miR-132-3p 靶向参与神经元可塑性的重要通路，如DNA 甲基化和神经元cAMP 反应元件结合蛋白（CREB）、N-甲基-D-天冬氨酸受体和BDNF信号［42］.后者似乎在中枢神经系统退行性疾病的病理生理中起着主要作用，并参与神经发育和突触的调节.miR-132-3p 通过调控BDNF 信号通路在中枢神经系统疾病的病理生理中发挥核心作用，导致常见的通路失调，最终导致认知障碍，这是中枢神经系统退行性疾病之间的共同特征［43］.因此miR-132-3p可能是中枢神经系统疾病治疗和预后的潜在指标.

5 结语

近年来，随着生物学研究方法和技术的不断更新，miRNAs 的功能也被不断地揭示出来.大量研究表明，miRNAs 转录后调控靶基因蛋白质的表达与中枢神经系统疾病的发病机制和病理生理有着密切的相关性.在中枢神经系统中miRNAs 调控着神经细胞增殖、分化、凋亡的过程；在病理过程中miRNAs 亦在疾病的发生发展、损伤后修复等方面发挥着重要的调节作用.进一步阐述miRNAs 在中枢神经系统中如何调控靶基因的表达并成为疾病的相关靶点，可以为研究中枢神经系统退行性疾病的发病机制提供新的分子基础.

尽管miRNAs 成为早期临床诊断中枢神经系统疾病的潜在生物标志物是十分有前景的，但仍存在挑战性.如存在种族、年龄、饮食和性别等影响miRNAs 表达的相关因素.因此，我们需要更大的样本量和专门的研究来验证miRNAs 在中枢神经系统疾病中的有效性.此外，一种miRNAs 在大脑的不同部位、不同阶段发挥作用机制也大不相同，如何精准地通过靶向药物通过血脑屏障将miRNAs 递送到病变部位仍需解决.因此，在miRNAs 成为临床诊治中枢神经系统疾病生物标志物之前，技术和方法的改进是十分必要的.