尿酸检测方法的研究进展*

江民川，赵 阳，马芳芳，张 微，刘春叶

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

尿酸(2,4,6-三羟基嘌呤,uric acid，简称UA)是人体内嘌呤代谢的最终产物。健康成年人血清中正常尿酸的水平为0.15～0.4 mmol/L。人体内的尿酸异常可以反映出嘌呤代谢相关疾病，是多种疾病可能的递质。据《2017年中国痛风报告白皮书》统计，中国高尿酸血症患者人数已达1.7亿。其中痛风患者超过8 000万人，并以每年9.7% 的增长率持续快速增加。现代临床研究表明，高尿酸血症还与Lesch-Nyhan综合症、心脑血管疾病、内分泌疾病、慢性肾脏、急性心肌梗死、脑梗死等疾病密切相关[1-3]，是这些疾病发生和发展的重要因素。因此有必要寻找一种快捷、方便、廉价、准确的检测方法对尿酸含量进行实时监测。作者将对现有尿酸检测方法进行综述，为该方法的发展提供参考。

1 常见尿酸检测方法

1.1 磷钨酸还原法

磷钨酸还原法自1984年发明以来，不断被改进完善，现已成为比较成熟的尿酸含量检测方法[4-6]。其检测机理为在碱性条件下，磷钨酸可将尿酸氧化成尿囊素和二氧化碳，同时自身被还原成钨蓝。经过滤光板或红色滤片滤除杂光,与同样处理的尿酸标准液进行比色,根据显现的颜色深浅程度不同，转化成浓度曲线。该方法的不足是线性关系不强、尿酸和蛋白质会产生沉淀、测试结果很容易受到其他还原物质如维生素C的影响[5，7-8]。

1.2 高效液相色谱法

高效液相色谱(HPLC)是尿酸检测的常见方法[9]，具有精密度高，分析速度快，样品用量少等优点[10]。其检测尿酸原理为在高压输液系统作用下，选择相同极性的单一溶剂、不同比例的混合溶剂以及缓冲溶液等作为流动相，样品在色谱柱中分离得出色谱图，通过标准曲线法与尿酸标准图谱比较得出尿酸浓度。该方法缺点为样品需进行前处理、寻找合适的色谱条件、依赖高精密的仪器等[10-11]，一定程度上限制了推广和应用。

1.3 分光光度法

分光光度法是基于尿酸在293 nm处有特定吸收峰或尿酸与某些试剂作用生成具有特定吸收峰的物质，因此分光光度法可分为直接吸光度法和间接吸光度法。前者根据样品的吸光度与标准尿酸溶液吸光度工作曲线作对比得出样品尿酸浓度，例如用铁氰化钾紫外法检测尿酸[12]；后者是根据尿酸转化生成特定物质的吸光度曲线，间接判定尿酸浓度，例如铁-邻二氮菲测量法[13]。分光光度法操作简便、迅速，但灵敏度稍差，血浆等样品中干扰物多且不易屏蔽，难以简单地将血浆中的尿酸含量与吸光度测量值进行比对，校正因子难以统一，线性拟合关系不够[14-15]。

1.4 尿酸传感器检测法

尿酸传感器主要分为电化学传感器和生物传感器。前者通过检测尿酸在尿酸酶的作用下产生的电信号强度，从而得出尿酸浓度；后者主要通过生物活性物质如酶，对尿酸的识别感应进行检测。电化学传感器具有灵敏度高、选择性好、实用性强等特点并逐渐成为尿酸检测的热门领域。电极材料不断丰富以及电极材料修饰方式的多样化[16-18]，为尿酸检测提供了一种可行的方法。目前已经有走出实验室的产品如电化学尿酸仪，根据用户反馈和专业机构评估结果，尿酸仪测量结果有一定的价值，但重复性不好，单次测量易产生较大误差[19-20]。

1.5 酶法

酶法是指在酶的参与下结合其他检测手段共同完成对尿酸检测的方法，如上述电化学传感器中的一些方法也需借助酶的参与。酶法原理为测定酶促反应后底物或者产物的浓度变化得出尿酸含量。根据直接定量的物质，酶法可以分为间接尿酸酶法和直接尿酸酶法，当考虑数据处理方法的不同，可分为平衡尿酸酶法和动力学尿酸酶法[21]。酶法的不足点在于测定尿酸时常伴有强竞争性酶抑制剂如黄嘌呤，酶的可获得性低、成本较高[22]。另外各种酶法检测需要特定条件，得出的结果不具有统一的评判标准，不具有可比性。

2 微流控纸芯片法

2.1 纸芯片法发展历史

使用纸张作为检测材料有着悠久的历史。17世纪，英国化学家罗伯特·波义耳从一个意外的实验发明了紫色石蕊试纸。近代以早孕试纸[23]为代表的免疫层析分析试纸[24]，即侧向层析检测成为纸芯片检测技术发展的一个转折点。2007年，Whitesides研究组[25]提出在纸张表面加工出具有一定结构的微流体通道，可用于葡萄糖等物质的检测，被认为是现代微流控纸芯片研究的开端。Henry研究组[26]紧跟其后，提出将纸芯片与电化学检测结合使用，弥补了传统比色法灵敏度低的缺陷。

2.2 纸芯片加工技术的进展

随着检测物质种类的增加和对检测结果精确度要求的不断提高，纸芯片加工技术也变得越来越多样化。按照纸张处理方法的不同，纸芯片加工技术可分为2种。物理修饰，即使用疏水试剂(如光胶、石蜡等)，对纸纤维的空隙进行填堵，从而形成疏水堤坝，如紫外光刻技术[25-32]、绘图技术[33-36]、蜡印技术[37-40]、喷墨打印技术[41-44]等；化学改性，利用化学反应将疏水试剂键合在纸张纤维表面，例如烷基烯酮二聚体(AKD)[45-46]、十八烷基三氯硅烷(OTS)[47]等。再通过紫外光刻处理技术，将其降解在纸纤维表面，从而形成亲水通道网络。此外，也可采用空气隔离技术，即依照需要的通道图案，直接对滤纸进行裁切或者雕刻，进而形成“空气-滤纸”界面的隔离带，将流体控制在“通道”之中。

2.3 微流控纸芯片法检测尿酸

利用微流控纸芯片对尿酸进行检测已有文献报道。王方方等[48]通过光刻法，组装出了一种三维纸芯片用于尿酸检测，其检测机理为将尿酸氧化酶和辣根过氧化酶固定在纸芯片上，尿酸被尿酸氧化酶催化生成H2O2，H2O2在辣根过氧化酶的催化作用下，发生鲁米诺反应而生成化学发光信号。化学发光信号的强度与被分析物的浓度呈线性关系，通过对化学发光信号强度的检测，可以完成尿酸的测量。该方法与电化学检测方法相比较，检测限降低了一个数量级，探索了纸芯片多元检测的可能性。赵甜甜等[49]在笔中注入亲脂性溶液，在滤纸上绘制圆形疏水图案，将纸芯片作为实验平台，利用纳米金团聚显色的特性，完成了血清中尿酸含量的快速检测。Huang等[50]基于葡萄糖和尿酸产生H2O2介导的催化氧化显色反应，利用双酶-无机杂化纳米氧化物作为纳米生物催化剂，建立了多重纸基纳米生物催化体系，可以同时检测葡萄糖和尿酸，检测限分别为60和25 μmol/L，已成功地用于检测人类全血样本中的葡萄糖和尿酸水平。Wang等[51]以智能手机作为信号读出器，研制出一种具有良好色度均匀性和强度的多层改性纸基比色传感平台，用于尿酸和葡萄糖的灵敏和选择性测定，该方法在0.01～1.0 mmol/L对尿酸具有良好的线性响应，在0.02～4.0 mmol/L对葡萄糖具有良好的线性响应，检出限分别为0.003和0.014 mmol/L，远低于之前的文献报道。

微流控纸芯片检测有着便捷、快速、绿色、廉价等特点，同时，微流控纸芯片生物检测系统和电化学检测系统分别在尿酸浓度与纸基颜色强度、电信号强度间建立了较强的线性关系，为其测量结果的准确性提供了保障。

3 结束语

除上述常见尿酸检测方法外，还有一些权威检测方法，如德国临床化学会(DGKL)、美国国家标准和技术研究院(NIST)、根特(Ghent)大学建立了血清尿酸检测的参考方法——同位素稀释-气相色谱质谱(ID-GC/MS)法[52-53]，中国国家计量院和卫生部临床检验中心建立UA同位素稀释液相色谱质谱 (ID-LC/MS) 法和同位素稀释液相色谱串联质谱 (ID-LC/MS/MS)法[54]。对比以上检测方法，微流控纸芯片法具有诸多优势，也存在一些不足之处尚待解决。例如，要准确测量全血中尿酸含量，需去除或降低干扰。尿酸检测中存在的干扰包括物理干扰和化学干扰，例如采用比色法进行全血测定时红细胞自身颜色的干扰，氧化还原法测尿酸时共存还原性物质如抗坏血酸、多巴胺的干扰。面对这些问题，可通过对样品进行简单预处理，如添加某种试剂对干扰物质进行屏蔽、在纸张表面附加固定相来完成对干扰物质的分离等方法进行解决。同时采用固定容积的采血针将血稀释成一定的倍数也可能使尿酸检测简化。目前微流控纸芯片技术还需不断发展完善，纸上实验室的构建还存在较大发展空间。相信随着纸芯片技术的发展，尿酸的检测将会变得更加简单，有望实现对全血中尿酸的实时检测。