鸡内源性白血病毒ev21 与其侧翼区 SNP 位点的连锁关系

葛琳涵，白少川，李雪梅，赵丽杰，乔 宁，李兰会,3

（1.河北农业大学 动物科技学院，河北 保定 071001；2.华裕农业科技有限公司，河北 邯郸 056000； 3.河北省牛羊胚胎工程技术研究中心，河北 保定 071001）

禽白血病病毒（Avian leukosis viruses，ALV）属于α 逆转录病毒类［1］。根据致病性和感染宿主的不同，ALV 被划分为A-J 7 个亚群，其中的A-D和J 亚群为外源ALV，E 亚群为内源性白血病毒［1-2］，禽内源白血病毒ALVE 是第一个被发现的内源逆转录病毒［3］。内源逆转录病毒属于逆转座子的1 种类型，物种进化过程中由逆转录病毒入侵脊椎动物基因组经历逆转座复制克隆而形成，是病毒感染后的基因组残骸。

内源病毒表达调控改变宿主生理，以病毒位点特异方式形成宿主-病毒间的互作，内源逆转录病毒对宿主的正效应产生新的适应性遗传变异和抗感染能力，负效应导致肿瘤等疾病发生［4］。ev21是E型内源逆转录病毒中的1 种，前人研究发现ev21与莱航鸡的慢羽表型连锁，影响慢羽鸡的特异免疫功能，导致慢羽莱航鸡产蛋性能下降、死亡率升高［5］。而目前更多的研究发现，ev21并不与慢羽连锁，并且有地方鸡的慢羽品系表现出更高的生产性能以及免疫性能［6-7］。内源性逆转录病毒与宿主基因组进化、基因调节等密切相关。然而，内源性逆转录病毒的转录调节紊乱会导致疾病的发生，对蛋、肉鸡的生长发育和生产有直接影响。因此，内源性逆转录病毒的活性需紧密调控，但其在宿主体内的活性调控机制尚不明确。

有研究认为，ALVE 的整合位置效应可能使其转录失活，1.5%的ALVE 位于基因编码区，远低于4.9%的随机整合预期比例［8］，这也表明ALVE 的整合位置对其产生某种影响。本课题组已经克隆获得ev21的完整基因组序列，发现ev21的LTR 区及其侧翼区对其转录具有调控活性［9-10］，但家禽如何控制具有LTR 调控活性的ev21的转录而保持健康，这一问题的解决对揭示宿主与内源逆转录病毒的和谐进化以及病毒的防控具有指导意义。该研究发现Z 染色体上的C＞T 突变与ev21整合的连锁关系，为解决该科学问题提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

海兰褐94 只、太行鸡168 只、海兰灰15 只和SPF 鸡15 只，4 个品种共292 份血液DNA 样品。

1.2 试剂

Easy pure 血液DNA 提取试剂盒，北京全式金生物有限公司；MobII 内切酶和DNA Marker，大连宝生物工程有限公司；2×TaqMasterMix，康为世纪生物科技有限公司；引物合成和测序由北京六合华大基因公司完成。

1.3 引物设计

利用Primer Premier 5.0 软件设计引物，引物信息见表1。SNP 位点的筛选和基因型检测用引物扩增区域见图1。

表1 PCR 引物信息Table 1 Primers for PCR experiments

ev21整合位点侧翼区SNP 位点筛选用引物P1s和P1a， 扩 增Z 染 色 体 上g.10681684-10682477（NC_006127.5） 的794 bp 序 列。ev21侧 翼 区SNP 位点基因型RFLP 检测用引物P2s 和P2a，其产物位于g.10681679-10682288，ev21占位区（OS）和未占位区（US）均能获得610 bp 的扩增产物；P3s 和P3a 引物扩增的1 ～356 bp 和357 ～ 1 036 bp 分别位于ev21基因组序列的5′末端和g.10681598-10682277，只有ev21整合的OS 区获得1 036 bp 的扩增产物。鸡羽型鉴别用引物P4s 和P4a、性别鉴定P5s 和P5a、以及ev21阴阳性鉴定P6s 和P6a，及其PCR 反应体系和条件分别参考文献［7, 9, 11］。

图1 ev21 整合侧翼区SNP 测序和酶切检测扩增区域结构示意图Fig.1 Schematic diagram for detection of SNP in ev21 flanking region

1.4 ev21 侧翼区SNP 位点筛选的PCR 扩增

筛 查ev21整 合 位 点 侧 翼 区SNP 用794 bp 序列PCR 扩增，反应体系为Mix 25 μL，正反引物各 2 μL，模板5 μL，ddH2O 16 μL，该体系为50 μL体系。反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环，72 ℃ 延伸7 min，最终4 ℃终止反应。PCR 产物送上海美吉生物公司进行测序。

1.5 SNP 位点基因型鉴定

1.5.1 OS 与US 共有区和OS 特异区的PCR 扩增610 bp 和1 036 bp 序列分别扩增OS 与US 共有区和OS 特异区，10 μL PCR 反应体系：Mix 5 μL，引物分别为0.5 和0.4 μL，模板分别为1 μL 和0.4 μL， ddH2O 分别为3 和3.8 μL。PCR 反应程序分别为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，退火温度退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 和32 个循环，72 ℃延伸7 min，4 ℃终止反应。

1.5.2 610 bp和1 036 bp酶切检测 610 bp和1 036 bp 的扩增产物2.5 μL 置于100 μL 离心管，加入内切酶MboII 0.5 μL、10×L Buffer 2 μL、ddH2O15 μL， 12 000 r/min 离 心5 s 混 匀。37 ℃金 属 浴1 h，取 8 μL 酶切产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 SNP 位点转录因子预测

利 用 在 线 软 件TRANSFAC®Professional 中的Patch1.0(http://gene- regulation.com/cgi-bin/pub/programs/patch/bin/patch.cgi)预测分析C＞T 突变可能引起的转录因子变化。

2 结果和分析

2.1 ev21 整合上游侧翼区SNP 筛选

794 bp 序列PCR 扩增产物送华大基因测序。使用BioEdit 软件比对分析79 个样品的794 bp 测序峰图，发现ev21 整合位点g.10681598 上游278 bp 处的C＞T 突变，位于鸡Z 染色体的g.10681876 位点，存在3 种基因型：TT、CC 纯合型和CT 杂合型（见图2）。

图2 794 bp 序列中C＞T 突变的测序峰图 Fig.2 The peak map for C＞T mutation in 794 bp sequence

对C＞T 突变位点基因型进行汇总，结果见表2。海兰褐和海兰灰分别有10 个和7 个ev21阳性个体，SNP 位点全部为TT 基因型；15 个和7 个ev21阴性个体，全部为CC 基因型。太行鸡的24 个ev21阳性个体，基因型为CT 杂合型；16 个ev21阴性个体中12 个为CC 纯合基因型，4 个CT 杂合基因型。由此推测， C＞T 突变的T 等位基因可能与ev21的整合存在连锁关系。为进一步明确ev21整合与该位点的连锁关系，增加样本数量，对C＞T 位点的基因型进行酶切检测。

表2 ev21 整合与C＞T 位点的基因型关系Table 2 Relation of ev21 insertion and C＞T mutation

2.2 ev21 侧翼区C＞T 位点基因型酶切检测

2.2.1 610 bp 产 物 酶 切 检 测 OS 和US 共 有 区610 bp 的酶切结果见图3。当突变位点为C 等位基因的610 bp 序列，形成的TCTTC 序列被内切酶MboⅡ识 别，610 bp 序 列 被 切 割 为209 和401 bp 2 条带，这种基因型定义为CC 纯合型；C＞T 突变位点为T 等位基因时，内切酶MboⅡ不能识别TCTTT 序列，610 bp 序列不能被切割，定义为TT纯 合 基 因 型；酶 切 后 为610 bp、209 bp 和401 bp 3 条带的，定义为CT 杂合型。

图3 610 bp 产物酶切凝胶检测Fig.3 Gel detection of 610 bp product digestion

2.2.2 1 036 bp 产物的酶切检测ev21阳性个体才能扩增1 036 bp 条带，对其进行MboⅡ酶切后1 036 bp 序列保持完整序列（见图4），得出ev21阳性个体在其整合位点OS 区上游278 bp 的C＞T位点全部为T 单倍型。

图4 1 036 bp 产物酶切凝胶检测Fig.4 Gel detection of endonuclease digestion for 1 036 bp sequence

2.2.3 不同品种鸡羽型、性别和ev21与C＞T 位点基因型 鸡的品种、性别、ev21整合性与C＞T 突变信息见表4。海兰褐祖代和海兰灰鸡中ev21阳性的慢羽鸡分别有18 和15 只，慢羽鸡存在US 和OS 2 个拷贝，C＞T 位点610 bp 酶切检测全部为TT 纯合基因型，1 036 bp 酶切检测全部为T 单倍型，说明ev21整 合 阳 性 的OS 区C＞T 位 点 为T 等 位 基因，而未占位US 区也为T 等位基因，所以海兰系列ev21阳性种鸡的C＞T 突变构成USTOST单倍型。海兰褐商品代和太行鸡的阳性慢羽鸡分别有29 和90 只，610 bp 酶切全部为CT 杂合型，1 036 bp 酶切为T 单倍型，构成USCOST单倍型。另外，海兰褐商品代和太行鸡各有2 只和40 只阴性慢羽鸡，其基因组的OS 区由于重组造成ev21缺失，从而使OS 区回复突变为US 区，所以慢羽ev21阴性鸡存在2 个拷贝的US 区。其610 bp 酶切为CT 杂合型，1 036 bp 无扩增产物，从而形成2 个US 区，构成USCUST单倍型。

表4 鸡的品种、性别、羽型和ev21 整合性与C＞T 位点基因型Table 4 Genotype of C＞T mutation in different breeds, feather types and ev21 integration of chickens

海兰褐祖代、商品代、SPF 鸡和太行快羽阴性鸡分别有30、10、15 和35 只，快羽鸡只存在US区或OS 区1 个拷贝，610 bp 酶切全部为CC 基因型，1 036 bp 无扩增产物，构成了USC单倍型。另外海兰褐商品代和太行快羽阳性公鸡各有5 和4 只，其610 bp 酶切全部为CT 杂合型，1 036 bp 酶切为T 单倍型，C＞T 突变形成了USC和OST2 种单倍型。

2.4 C＞T 突变引起的转录因子变化预测

利用在线工具TRANSFAC®Professional 分析C＞T 突变引起的转录因子变化，发现C 单倍型有CDC2、CDC25C、CCNA2，这3 个转录因子为调节细胞分化的负调控元件，在细胞的G0 和G1 期发挥抑制作用，可能对ev21转录表达的致细胞肿瘤毒性起到强化作用［12］。而T 单倍型型有EN、GR、PR-alpha 和AR，EN 转录因子发挥转录抑制作用，预测起到ev21的转录表达抑制作用；GR、PR-alpha和AR 分别为糖皮质激素受体、孕酮受体、雄激素受体转录因子，发挥抗应激、免疫调节等作用［13-15］。

3 讨论和结论

本研究发现，快慢羽鸡ev21整合位点上游 278 bp 处的C＞T 突变，在OS 和US 区构成5 种单倍型。快羽鸡只包含ev21的OS 区或US 区，有2种单倍型分别为OST和USC型；慢羽鸡包含OS 区和US 区2 个重复区域，有3 种单倍型，为慢羽阳性鸡的USCOST单倍型，海兰慢羽阳性种鸡特异的USTOST单倍型，以及慢羽ev21阴性鸡的USCUST单倍型，可能源于ev21的重组缺失，使OS 区回复突变为US 区，但C＞T 位点仍保留为T 单倍型。结果表明，ev21整合位点上游278 bp 处的C＞T 突变，ev21整合与T 等位基因连锁。

3.1 内源性逆转录病毒在宿主基因组整合的非随机性

ev21整合域的OS 区存在保守的T 等位基因，这可能与保持内源病毒在宿主机体内的稳定性有关。Boulliou 等发现US 区存在3 个多态位点，分别被HaeⅢ、Hind Ⅲ和ApaL Ⅰ内切酶识别，而这3 个多态位点在OS 区不存在多态性，与本试验发现的MobII 酶切位点特征一致，说明OS 区序列保守性与ev21的结构稳定性或功能保守性有关。内源性病毒基因组在宿主体内的相对稳定性表明其对基因组可塑性的诱导从而增强进化适应性，与宿主间存在长期进化合作共生关系［16］。

Wallace 等利用全基因组测序数据和计算机流水线发现46 个人内源病毒位点整合多态性与邻近标记的SNP 存在连锁关系［17］。虽然一般认为内源逆转录病毒在宿主基因组的整合是随机的，但是宿主基因组序列对其整合可能具有内在的调控机制。外源病毒倾向于整合在细胞的开放染色体，尤其是蛋白编码基因附近，尽管内源病毒可能具有相似的生物偏好，Mason 等研究发现内源白血病毒的整合并非随机的［18］，人工或自然选择可能会剔除有害的内源病毒元件。本研究发现的T 等位基因与ev21整合的连锁关系，一定程度证明了其整合的非随机性。

3.2 C＞T突变引起的转录因子变化稳定ev21 的整合

对C＞T 突变引起的转录因子变化预测分析发现，T 单倍型下增加了EN、GR、PR-alpha 和AR转录因子的可能结合，EN 发挥转录抑制作用可能与机体细胞ev21的低转录表达及其低细胞毒性有关，GR、PR-alpha 和AR 的转录结合与宿主细胞的免疫调节、抗应激有关［19-20］，保证了ev21与鸡宿主的和平共处共进化表达。C 单倍型下增加了CDC2、CDC25C、CCNA2 转录因子的结合，发挥细胞分化抑制作用与ev21的细胞肿瘤致毒性病变有关［21-22］，导致宿主癌变致死。ev21阳性个体的C＞T 突变位点全部为T 单倍型，推断认为C 单倍型下的ev21具有较强的转录活性，对细胞造成较强的癌变致死毒性，所以C 单倍型的ev21整合个体全部致死淘汰，而只有与ev21整合连锁的T 单倍型个体被保留繁衍。当然，其可能的机理还需试验验证。

OS 区上游278 bp C＞T 的T 突变型与ev21整合紧密连锁，可能源于结合转录因子改变影响ev21的转录表达，最终使ev21感染的T 单倍型个体存活保留下来，而C 单倍型个体由于ev21的强毒性被淘汰。该研究发现为探究内源逆转录病毒与宿主的共进化关系提供理论参考，为加速我国无内源病毒的种禽的分子选育提供借鉴，关于C＞T 突变与ev21的转录表达间的调控关系有待进一步研究。