生石花离体培养与快繁研究

邢一帆，陈 丽，张 杰，宋婷婷

(北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206)

生石花(Lithopskarasmontana)是番杏科生石花属多年生的肉质草本植物，体型小，像石头半埋在地下，常见于岩床缝隙、石砾之中，盛夏至中秋开花，又名石头花[1]。生石花形如彩石，色彩丰富，株型小巧，一般盆栽于室内观赏，作为一种形状多样的盆栽植物广受大众的喜爱，其观赏价值高，同时可以起到净化空气的作用，符合大众对于花卉的消费趋势。生石花作为一种多肉植物，由于其独有的特征，更是吸引越来越多人的喜爱，需求量逐渐上升导致其价格随之上涨[1]。

生石花的繁殖靠种子或扦插[2]。由于扦插是由一个植株自然形成多个头后，繁殖产生新植株，因此人们更侧重于种子繁殖。一般采用室内盆播，种子很容易发芽，但生石花的种子细小，从播种到成苗时间约2～3年，繁殖系数较低，难以满足生产需要。为满足市场的需求，快速大量繁殖生石花成为一个重要的问题[2]。

近年来，植物组织培养作为快速繁殖的方法在不同植物中被广泛应用，其不但可以缩短植物的生长周期，更为植物脱毒苗的培育提供可参考的方式。尽管部分多肉植物已经能够通过组织培养的方法快速繁殖，如白银寿[3]、短叶巨象[4]、水晶掌[5]、白银寿‘奇迹’[6]、玉露[7]，但有关生石花组织培养的报道还很少，只有种子的繁殖体系被建立，其叶肉组织培养体系尚未建立[8]。生石花与其他多肉植物的品种差异性较大，常规的培养基不能共用[3-7]。该研究以生石花的叶肉作为试验材料，利用组织培养的方法，筛选适宜生石花外植体离体培养的消毒时间、激素质量浓度等条件，建立生石花快繁体系，旨在获得品质优良、生长快速的种苗，为后续生石花的品种培育和工厂化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

生石花品种‘花纹玉’购买于北京花乡花卉市场，以生石花的叶肉作为材料。培养于北京农学院科技综合楼组培室，环境条件设置：光照强度2 000 lx，光照14 h/d，温度(23±2) ℃，相对湿度55%[9]。

1.2 材料处理

外植体灭菌：选用大小相近的成熟生石花叶肉，清洁剂浸泡约15 min，自来水冲洗30 min备用。在超净台上用75%的乙醇冲洗，2%NaClO溶液浸泡，组合分别是5 s 75%的乙醇和8 min 2%NaClO溶液，5 s 75%的乙醇和12 min 2% NaClO溶液，30 s 75%的乙醇和8 min 2% NaClO溶液，30 s 75 %的乙醇和12 min 2% NaClO溶液；无菌水浸泡1～2 min，冲洗3～5遍。将消毒后的叶肉放置在无菌滤纸上，切成1～1.5 cm段作为外植体，接种到启动培养基上。

1.3 试验步骤

1.3.1 培养基种类和配方 启动培养基4种：培养基A1、培养基A2、培养基A3、对照培养基。培养基A1：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L；培养基A2：MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L；培养基A3：MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.8 mg/L；对照培养基：MS(不添加任何生长调节剂)。

诱导培养基3种：培养基B1、培养基B2、对照培养基。培养基B1：MS+NAA 0.4 mg/L+6-BA 2.0 mg/L；培养基B2：MS+NAA 0.8 mg/L+6-BA 4.0 mg/L；对照培养基：MS(不添加任何生长调节剂)。

生根培养基4种：培养基C1、培养基C2、培养基C3、培养基C4。生根培养基配方为1/2MS基本培养基，琼脂粉7 g/L，蔗糖20 g/L，pH调至6.0。培养基C1：1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.00 mg/L；培养基C2：1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L；培养基C3：1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.01 mg/L；培养基C4：1/2MS+6-BA 0 mg/L+NAA 0.10 mg/L。

1.3.2 启动培养 将试验材料放置于启动培养基上。培养基pH调至6.0，蔗糖30.0 g/L，琼脂7.0 g/L。每瓶培养基接种4个外植体，共计4个处理，每个处理5个重复。接种30 d后观察组培瓶内外植体的生长状态，待其生长成熟后备用。

1.3.3 愈伤组织的诱导培养 将膨大的外植体切割为长约1.0 cm的段，随后接种到诱导培养基上。每瓶培养基接种4个外植体，共计3个处理，每个处理5个重复。接种30 d后观察组培瓶内外植体的生长状态及愈伤组织的生长情况，筛选出最佳诱导培养基。

为检测生石花芽的分化率，将生长状态较好的愈伤组织分别接种在适宜的诱导培养基上，每瓶接种5块愈伤组织，设置5个重复，30 d后观察并统计结果。

1.3.4 生根培养 待植株长至2 cm以上时，通过无菌操作将其转移至生根培养基中。每瓶接种丛生芽3个，每处理5个重复，光照时间延长为16 h/d，30 d后统计生根率及生根条数，选择最适的生根培养基。

1.3.5 炼苗与移栽 待植物组织的根系健壮，能够达到移栽的状态后进行炼苗处理。炼苗的具体步骤：在无菌室内先松盖1～2 d让其适应外界环境，部分开盖，直至完全揭盖；然后移到室外进行自然光照7～10 d，遮阴约为60%，炼苗完成后将组培苗进行移栽。

2 结果与分析

2.1 无菌率及成活率

生石花外植体进行消毒处理试验，设置75%的乙醇和2%的NaClO溶液的4种不同时间梯度，经过30 d培养，5 s 75%酒精和8 min 2% NaClO溶液的处理最合适，外植体愈伤组织膨大，有分化趋势，并且无菌率高达41.2%，成活率高达45.6%(表1)。虽然将2%的NaClO溶液的消毒时间延长至12 min后，愈伤组织生长旺盛，却产生乳白色污染(图1)。另外，尽管30 s 75%的乙醇和8 min NaClO溶液的处理无菌率和成活率较高，但是愈伤组织小、紧皱，没有分化趋势，不适合后期的植株生长。

表1 不同消毒时间对生石花愈伤组织的影响Tab.1 Effects of different disinfection methods on Lithops karasmontana callus

注：小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate that there is significant difference (P<0.05).

2.2 启动培养

将外植体接种到启动培养基上，其中培养基A1为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，愈伤组织状态较好，生芽率高，分化效果良好；出芽率高达65.2%。培养基A3的出芽率31.4%，但是愈伤组织状态不好，呈现出黄绿色，仅有少量芽点出现，分化一般；培养基A2和对照培养基的出芽率不足10%。培养基A1确定为最佳启动培养基，见表2。

表2 不同激素组合对生石花愈伤诱导的影响Tab.2 Effects of different combinations of hormones on callus induction of Lithops karasmontana

注：小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate that there is significant difference (P<0.05).

2.3 愈伤组织的诱导培养

外植体由于经过启动培养后膨大，需将其切割成1.0 cm左右，再接种到诱导培养基上，进行筛选。其中培养基B1：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂，愈伤组织诱导率高达65.7%，丛芽分化率高达75.2%，培养基B1确定为最佳诱导培养基，见表3。培养基B2愈伤组织诱导率高达53.5%，丛芽分化率高达58.4%，仅次于培养基B1对外植体的影响，同时说明激素质量浓度越高，对植物的生长不是越好[5,10]；由于培养基B3没有加入激素，愈伤诱导率和分化率均为0，不具有影响能力，结果如图1所示。

2.4 生根培养

为了确定生石花的最适光照时间，将即将生根的植株放置于8 h和16 h的光照条件下，30 d后，植株在16 h的时间范围中，无论植株形态或根生长情况都符合正常观赏要求，且颜色美艳(图2)。而8 h光照条件下的植株由于光照不够，长势奇怪，不符

表3 不同激素质量浓度对生石花愈伤增殖和分化的影响Tab.3 Effects of different hormone concentrations on callus proliferation and differentiation of Lithops karasmontana

注：小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate that there is significant difference (P<0.05).

培养基6-BA/(mg/L )NAA/(mg/L)平均根数生根率/%C11.01.000.00.0C20.50.109.951.4 aC30.10.016.318.5bC40.00.105.68.3 c

注：小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate that there is significant difference (P<0.05).

合生石花的观赏特征，所以，试验最终将最佳光照时间设定为16 h(图3)。

待生石花植株长至2 cm以上时，在无菌条件下取出健壮植株，接种到生根培养基中进行培养。其中培养基C2：1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，平均根数最多为9.9，生根率最高，达到了51.4%，培养基C2确定为最佳生根培养基，见表4。

3 讨 论

该试验以生石花叶肉作为外植体，通过设置不同消毒时间处理，筛选出5 s 75%乙醇和8 min 2% NaClO溶液为最适消毒方式，但是为了进一步提高外植体的无菌率和成活率，消毒时间仍需要继续优化改良。30 s 75%的乙醇和8 min 2%的NaClO溶液的消毒时间使得材料愈伤组织小，愈伤组织上多白色透明细小珠点，材料的愈伤组织明显减少，并且紧实。当外植体接种到启动培养基中，经过30 d培养后，观察外植体变化情况。培养基A1、培养基A2、培养基A3的外植体呈现膨大和愈伤化现象，对照培养基外植体萎缩，无分化。对4种试验处理后的外植体状态进行比较，只有当培养基中6-BA 2.0 mg/L时，生石花叶肉切面分化出具有增殖能力的黄绿色愈伤组织，能够在后续过程中继续诱导和分化[11-12]。培养基配方为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L时，出芽率高达65.2%。激素对植物组织分化的形成具有重要作用，选择合适的激素质量浓度对植物组织培养十分重要[13]。由于多肉植物的快繁体系多以1/2MS作为基本培养基[14]，该试验采取相同的方法，培养效果良好。与此同时，在1/2MS培养基中加入适量NAA能够有效诱导植物生根[4,8,15]，生根率可达51.4%。根系质量良好，明显高于未添加NAA的对照培养基。生根后的植物材料移栽成功率高达90%，生长良好。

由于生石花原产于热带地区，其在引种之前接受的光照时间和光照强度显著高于培养条件。高强度的光照使其具有颜色鲜艳，茎部粗壮等特点，而缺乏光照会对其生理状态造成至关重要的影响[1,16]。8 h条件下，植株出现畸形等症状，不适合观赏；而16 h的光照条件下，植株形态优美，且颜色美艳。该试验最终将最佳光照时间设定为16 h，与前人的研究结果一致[1,17]。

该试验以生石花的叶肉为试验材料，对消毒时间和质量浓度进行筛选，确定最适宜的培养基条件，建立组培快繁体系。该体系能够快速、高效繁殖生石花组培苗植株，缩短育种周期，提高外植体的生根率。提高生石花生长速度，弥补了繁殖效率低等缺陷，获得完整的生石花组织快繁体系，提高种苗质量，可用于生石花的大量生产繁殖，是一种通用性强，建立繁殖速度快的生石花组织培养体系，为今后生石花组培苗生产提供参考。