牛冠状病毒N蛋白的原核表达及核酸适配体筛选

程如楠，孔梓安，曹 莉，孙 路，岳 亮，王 真

(北京农学院动物科学技术学院，北京 102206，中国)

牛冠状病毒(Bovine Coronavirus，BCV)是引起新生犊牛拉稀、成年牛冬痢和呼吸道疾病的重要病原之一[1]。自19世纪70年代Mebus等[2]首次在腹泻犊牛和成年牛粪便中检测出牛冠状病毒之后，在多个国家相继发现了牛冠状病毒，目前牛冠状病毒病广泛流行于世界各国，对养牛业影响很大。由于牛冠状病毒病的治疗没有特效药，早期诊断和疫苗接种是目前较有效的预防措施[3]。目前，牛冠状病毒的检测方法有病毒分离鉴定、电镜鉴别、中和试验、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、RT-PCR等，而这些方法不同程度存在操作复杂、容易出现误差、费时费力且价格昂贵等问题。而利用指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)获得的适配体特异性好、成本低、易于合成和保存，且具有抗体相似的特性，能很好解决现有诊断方法的缺陷。

牛冠状病毒基因约27～32 kb，包含2个开放阅读框和5个结构蛋白基因，分别表达棘突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)、小膜蛋白(E)、包膜蛋白(M)和血凝素-酯酶蛋白(HE)5种[4]。N蛋白通过与基因组RNA、M蛋白之间相互作用，在病毒体中发挥重要的结构作用；参与基因组RNA合成的复杂机制，与病毒复制酶-转录酶复合物密切相关[5]。N蛋白除参与复制、转录、翻译等过程外，还可增强机体细胞免疫，产生保护性反应[6-7]。由于N蛋白基因序列高度保守，N蛋白常作为该病的检测抗原。

适配体也称核酸适配体，是基于SELEX从人工合成的寡核苷酸文库中筛选出与靶标高特异性、高亲和力结合的DNA或RNA小片段单链[8]。靶分子可以是核酸、肽、蛋白、细胞等多种物质，而且适配体成本低、免疫原性低和可化学修饰的优点使其成为生物领域的研究热点。

该研究首先原核表达出高纯度高浓度的N蛋白，借助SELEX筛选获得牛冠状病毒N蛋白的特异性核酸适配体，为后续建立酶联适配体方法奠定基础，对牛冠状病毒病的诊断和治疗具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材 料

牛冠状病毒N蛋白编码基因及扩增引物(均由北京擎科新业生物技术有限公司合成)，人工合成随机寡核苷酸库(84 bp)5′-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-(N)40-CTGCAGGTCGAC GCATGCGCCG-3′(N=A，T，C，G)及适配体筛选特异性引物(由北京擎科新业生物技术有限公司合成)；原核表达质粒pET-28a(+) (北京农学院动物疫病防控研究室保存)；BamHⅠ、XhoⅠ限制性内切酶(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；高纯质粒小量快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒、短片段DNA胶回收试剂盒、零背景pTOPO-TA Simple克隆试剂盒和PCR所用试剂(均购自北京艾德莱生物科技有限公司)；BL21和DH5a感受态细胞(均购自北京全式金生物技术有限公司)；His标签可溶性蛋白纯化试剂盒(购自康为世纪生物科技有限公司)；其他试剂均为分析纯(购自国药集团)；相关引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.2 方 法

1.2.1 N蛋白重组表达载体构建 借助 Primer Premier 5.0设计N蛋白编码基因特异性扩增引物，并将BamHⅠ、XhoⅠ 酶切位点分别插入上游引物和下游引物中。以合成的N蛋白编码基因序列为模板，扩增目的基因(PCR体系：2×Mix 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，目的基因模板2 μL，ddH2O为21 μL；PCR程序：预变性95 ℃ 5 min，变性94 ℃ 40 s，退火64 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min，延伸10 min，共30个循环)，并按照质粒提取试剂盒说明书从37 ℃过夜培养含pET-28a(+)的E.coli中提取pET-28a质粒。将扩增的基因产物及提取的质粒分别进行双酶切、电泳、纯化，其中酶切体系为质粒40 μL、10×Buffer 5 μL、ddH2O 1 μL、BamHⅠ 2 μL、XhoⅠ 2 μL，纯化根据胶回收试剂盒说明书进行。随后二者于22 ℃水浴锅连接2 h。连接体系(20 μL)为目的基因12 μL、质粒5 μL、Buffer 2 μL、ddH2O 0.5 μL、T4 DNA连接酶0.5 μL。连接产物转化BL21感受态细胞中，使用卡那抗性的LB平板培养，筛选转化成功的阳性克隆。最后挑取阳性克隆增菌培养2 h，并将其为模板进行扩增，以鉴定目的基因是否成功导入，若出现阳性条带则送公司测序进一步验证。

1.2.2 N蛋白的表达和纯化 取1.2.1步骤获得的阳性菌液进行平板划线，用卡那抗性的LB培养基，于37 ℃摇床培养单菌落至OD600=0.6。此时加IPTG诱导目的蛋白表达，诱导培养2、4、6 h的菌液用SDS-PAGE鉴定分析，并设置未诱导组和空载体为对照。前期SDS-PAGE分析得知牛冠状病毒最佳表达条件是终浓度1 mmol/L IPTG 37 ℃继续培养6 h，且该蛋白为上清表达。对诱导得到的菌液离心、洗涤，加入适量磷酸盐缓冲液悬浮菌体，超声法裂解细菌，离心保留上清溶液。使用康为世纪可溶性蛋白纯化试剂盒对上清中的目的蛋白进行纯化，为提高纯化效率，利用试剂盒中原有Binding Buffer(NP-10)和Elution Buffer(NP-500)按一定比例配置咪唑为40 mmol/L的Binding Buffer(NP-40)。先用10倍柱体积的NP-10平衡层析柱，随后将N蛋白进行挂柱，再用10倍柱体积的NP-40将多余杂蛋白洗去，最后用NP-500把目的蛋白洗脱下来，洗脱流速为1 mL/min。前3滴洗脱液弃去，其他洗脱液需收集保存进行检测。取50 μL纯化的蛋白与10 μL 6×上样缓冲液混匀，煮沸10 min，然后进行SDS-PAGE检测纯化结果，纯化得到的蛋白可长时间保存在-80 ℃。

1.2.3 N蛋白核酸适配体的筛选 将N蛋白包被在ELISA酶标板上，4 ℃过夜；倒掉包被液后用HEPEST洗3次并拍干；加入含有3%的BSA的HEPES，37 ℃封闭2 h；HEPEST洗涤后，加入适配体文库孵育2 h，再洗4次；加核酸洗脱液，采用酚抽提法提取洗脱液中的适配体；最后对适配体分别进行一轮对称和非对称PCR(对称PCR体系为2×Mix 25 μL，WZ-02 1 μL，WZ-04 1 μL，适配体 3 μL，去离子水 20 μL；反应程序为95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共15个循环。非对称PCR体系为2×Mix 25 μL，WZ-02 1 μL，WZ-04 0.02 μL，适配体 5 μL，去离子水 19 μL；非对称PCR反应程序与对称PCR基本相同，循环设为28次)。纯化的适配体由小片段DNA胶回收试剂盒收集。为了避免非特异性结合，第5轮起执行反筛操作：在包被时设置无N蛋白包被液的反筛孔，其他步骤不变。

1.2.4 核酸适配体序列测定 最后一轮筛选出的适配体PCR产物(84 bp)连接到T载体(约160 bp)上，并把得到的连接产物(约240 bp)转化DH5а感受态细胞，37 ℃摇床培养1～2 h，经离心浓缩后取200 μL涂在卡那抗性LB固体平板上，置37 ℃温箱培养18 h。使用通用引物M13R和M13F扩增平板上的白色单菌落，经电泳挑选出条带大小符合预期的PCR产物送公司测序。

1.2.5 间接酶联适配体试验(I-ELAA)测定适配体KD值 先对第11轮筛选并测序成功，且重复频率高的3条适配体(N-12、N-33和N-45)在5′端进行生物素标记，再使用I-ELAA法测定各条适配体的亲和力。首先，将0.5 mg/mL的N蛋白包被酶标板，4 ℃冰箱过夜，次日使用HEPEST洗板3次，加入1% BSA，37 ℃封闭2 h，向孔中加入0～100 nmol/L不同浓度的Bio-aptamer，37 ℃作用1 h后重复洗板5次，然后向孔中加入1∶6000稀释的二抗 HRP-SA，37 ℃作用1 h，洗板后显色，用酶标仪测定每孔450 nm处吸光光度值(OD)大小。根据公式Y=Bmax/(KD+X)计算每条适配体KD值。其中Y是OD450平均值；Bmax是OD450最大值；X是适配体浓度。

1.2.6 核酸适配体二级结构预测 将测序结果在核酸结构预测软件MFOLD分析其二级结构，软件网址为http://mfold.rit.albany.edu。

2 试验结果

2.1 牛冠状病毒N蛋白编码基因的扩增

使用合成的引物对N蛋白编码基因进行PCR扩增，将获得的PCR产物上样、电泳，获得约1 363 bp的目的条带，与预期结果相符，说明成功扩增出N蛋白编码基因，见图1。

2.2 目的蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测

加入IPTG诱导6 h后，经SDS-PAGE检测，成功在上清中表达出相对分子质量约为55 kD的目的蛋白，见图2。

2.3 N蛋白适配体的筛选

利用微孔板法对N蛋白的适配体进行筛选，共筛选11轮。使用引物WZ-02和WZ04对筛选出的适配体进行PCR扩增，配制2%琼脂糖凝胶并将对称PCR产物和非对称PCR产物上样电泳。凝胶成像仪显示扩增产物约84 bp，大小符合预期。部分PCR结果见图3和图4。

2.4 菌液PCR鉴定及序列测定

菌液PCR扩增产物的电泳结果见图5。将第11轮筛选的PCR产物与T载体连接后转化的DH5а感受态细胞涂板培养，使用M13F和M13R通用引物对135个单菌落进行PCR扩增，扩增产物

编号Number核酸随机序列Random sequence of nucleic acid重复次数RepeatN-12TAAAGCAACACGAATCCCCACACAGACATCGAAATGCGG8N-33ATTAAAAAACATTGGACTATAAACATGTATTGCCCGGTGC14N-45GGCCTGCGTCATTTCACTTGCGCTGCCATTATCTTCTCTC11

进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定出123个阳性克隆，部分PCR电泳如图5所示。提取123个菌液的质粒送样测序，共测出67条序列，其中N-12、N-33和N-45重复次数较多，说明这3条适配体对N蛋白具有较高的亲和力，其核苷酸序列见表2。

2.5 适配体KD值测定

适配体N-12、 N-33和 N-45出现的频率较高，故使用I-ELAA试验对其KD值进行测定(表2)。使用软件GraphPad Prism 5.0处理数据，公式Y=Bmax/(KD+X)算出3条核酸适配体KD值分别为32.81 nmol/L±4.75 nmol/L、19.61 nmol/L±8.36 nmol/L和21.01 nmol/L±5.48 nmol/L，其中N-12的KD值较高。此3条核酸适配体KD值均在纳摩尔级，符合试验要求。

2.6 适配体二级结构预测

使用在线软件预测适配体N-12、N-33和N45的二级结构，结果如图6所示，3条特异性适配体均具有各式的环状、发卡状结构。

3 讨 论

对牛冠状病毒病检测技术而言，检测的灵敏度、特异性、稳定性、成本及操作方法的简便性等方面非常重要。基于抗体的酶联免疫检测技术，在抗体的提取和纯化上存在步骤烦琐、成本高、不稳定、制备时间长等缺点。而与抗体相比，核酸适配体既可人工快速合成，而且在高温等条件下更加稳定，能在变性和复性中保持功能[9-10]。此外核酸适配体具有低免疫原性、易于化学修饰、低成本的良好特性。适配体具备如此多的优势，有望替代抗体建立新的疾病检测方法。为了探索新的经济有效的牛冠状病毒病诊断方法，该试验基于核酸-蛋白特异性结合原理，利用原核表达系统和SELEX，对核衣壳蛋白的核酸适配体进行筛选。经微孔板法多次、反向筛选最终得到多条与N蛋白特异性结合的适配体。其中N-12、N-33和N-45这3条适配体序列重复率较高。适配体筛选有多种方法，该研究中选用微孔板法进行筛选，虽然耗时较长但对靶分子、仪器的要求低，低成本条件下仍能获得特异性适配体。核酸适配体通过形成特定的二级结构如发夹、环状、凸起、G4聚体等与靶分子特异性结合，达到识别目的[11]。该研究中所得N-12、N-33和N-45适配体均具有结构各式的环状和发卡结构，与牛冠状病毒N蛋白空间结构上特异性结合。故N-12、N-33和N-45在牛冠状病毒病检测方面具有应用潜能，后续将使用N-12、N-33和N-45适配体，优化和建立一种酶联适配体的检测方法，为牛冠状病毒病的早期快速诊断奠定基础。