一种利用荧光酶标仪快速确立药动学参数的方法

2021-01-08李知宗刘惊涛陈恒玲林显光

绿色科技 2020年22期

李知宗，刘惊涛，陈恒玲，林显光

(中南民族大学生物医学工程学院/脑认知国家民委重点实验室/医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室，湖北武汉 430074)

1 引言

近年来，多肽类药物在各类疾病中得到了快速发展。为了更加准确地掌握药物在体内的吸收、代谢规律，就需要对其药代动力学进行研究。目前，对药动学参数的研究大多采取HPLC、LC-MS，成本较高[1]。因此，本文利用荧光酶标仪，对肽类药物药动学参数的确立进行改良，为后续研究提供理论基础。

2 实验材料与仪器

2.1 实验动物

雄性SD大鼠，SPF级，体重180～200 g，购买于湖北省疾病预防控制中心。饲养于12h光照/12h黑暗的环境中，自由摄食饮水。动物实验与处理均遵照《中南民族大学实验动物使用与福利指导手册》。

2.2 实验试剂与仪器设备

实验试剂如表1所示，主要仪器设备如表2所示。

表1 主要实验试剂

表2 主要仪器设备

3 实验方法

3.1 溶液的配制

(1)0.9%的生理盐水：称取4.5 g 氯化钠溶于500 mL超纯水中，灭菌后分装。

(2)20%的溶液：称量8 g 溶于40 mL的生理盐水中，备用。

(3)荧光标记肽COX52-69按每管2 mg分装，避光环境下，每管溶于0.85 mL生理盐水中，冻存于-20 ℃备用。

3.2 设立阳性对照

实验前将大鼠断粮12～16 h，饮水不限。将大鼠固定于实验动物固定器中图1(a)，鼠尾暴露于笼外。用橡皮筋或缝合线捆扎鼠尾根部，置于40 ℃热水中5～10 s，使鼠尾静脉充盈肿胀，易于显现静脉。右手持针，尽量使进针处血管与针头方向平行，针头平行于鼠尾刺破表皮图1(b)，若可见回血，则左手捏住鼠尾，右手推拉注射器活塞，制造负压，抽取1.5 mL血液[2]。取血结束，用脱脂棉球按压针眼部位30 s，确定止血后放开大鼠。

将取得的血液置于4 ℃冰箱中静置2 h后，利用低温高速离心机(1000 r/4°，10 mins)进行离心，分离上层血清于新的EP管中，再用低速离心机(500 r/min)进行复离，得到上层血清300 μL。避光环境下，精确称取0.7 mg荧光标记肽粉末，加入血清中，利用涡旋振荡器混匀，作为阳性对照。将血清按照每孔50 μL加入96孔板，并将96孔板放入酶标仪的测量小室中。调整酶标仪的测量参数，激发波长488nm，发射波长521nm，测量时间100ms，激发带宽12nm，并在测量前轻微震荡板壁，使血清平铺孔底。

图1 大鼠尾静脉取血

3.3 荧光肽COX52-69半衰期的测定

选取180～200 g 的SD大鼠，于实验前12～16 h断粮，并随机分为实验组与空白组。对所有大鼠进行尾静脉取血。取血完成后，实验组以2.5 mg/kg对大鼠腹腔注射荧光标记肽COX52-69，空白组以2.5 mg/kg对大鼠腹腔注射生理盐水。注射完成后，以2 g/kg对两组大鼠灌胃20%的溶液，并将此刻记为零时刻。于15、30、45、60、75、90、105、120 min分别取静脉血。将所有血液样本于低温避光环境下静置2 h，利用低温离心机分离上层血清。将血清按照每孔50 μL加入96孔板，并将96孔板放入酶标仪的测量小室中。调整酶标仪的测量参数，激发波长488 nm，发射波长521 nm，测量时间100 ms，激发带宽12 nm，并在测量前轻微震荡板壁，使血清平铺孔底[3]。将测得的荧光强度(RFU)按公式(1)转化为血药浓度。荧光标记肽COX52-69浓度计算公式为：

(1)

4 结果与分析

腹腔注射荧光标记肽COX52-69的血药浓度-时间曲线及药代动力学参数

根据阳性对照对实验组进行计算，利用DAS 2.0绘制所得腹腔注射荧光标记肽COX52-69的血药浓度-时间曲线及药代动力学参数见图2、表3。

5 结语

近年来，越来越多的多肽药物被开发并用于临床。多数已被FDA批准并用于临床的多肽类药物具有用药量少，选择性强，特异性好，作用效果显著，毒副作用小等优点[4]。COX52-69是从猪小肠中分离提取的一种短肽。为了更加准确的掌握短肽COX52-69在体内的吸收、代谢规律，就需要对其药代动力学参数进行研究。本实验对短肽COX52-69进行修饰，在其N端连接绿色荧光素FITC，对大鼠进行腹腔注射荧光标记肽COX52-69，利用荧光酶标仪对给药后不同时段的大鼠血清进行检测[5]，通过阳性对照组求得大鼠血清的血药浓度，利用DAS 2.0绘制血药浓度-时间曲线。目前，对药动学参数的研究大多采取HPLC、LC-MS，成本较高。该方法对肽类药物药动学参数的确立进行改良，可以快速确立短肽COX52-69的药代动力学参数，同时具有低成本的优点。