甜菜夜蛾SeKr-h1基因分子表达特性及其对保幼激素类似物的响应

赵静 谭永安 房菊 朱友雯 姜义平 肖留斌

摘要：Krüppel homolog 1（Kr-h1）是保幼激素（JH）的早期响应基因，在JH抑制幼虫或若虫变态及促进成虫生殖中发挥关键作用。利用 RT-PCR技术克隆甜菜夜蛾SeKr-h1α基因，并进行了生物信息学分析，序列分析结果显示，SeKr-h1α开放阅读框长度1 068 bp，编码355个氨基酸。与美国国家生物技术信息中心（NCBI）上已有的甜菜夜蛾Kr-h1β序列相比，SeKr-h1α N端缺少12个氨基酸。通过荧光定量qPCR研究甜菜夜蛾不同发育时期SeKr-h1α/β的表达水平，结果显示，SeKr-h1α/β表达趋势一致，SeKr-h1α为主要表达的转录产物。SeKr-h1α/β在幼虫末期、预蛹和成虫期高表达，1～4龄幼虫和蛹期维持低表达。在幼虫和蛹末期施用JH类似物Methoprene，qPCR检测SeKr-h1对JH的诱导响应表达，结果显示Methoprene处理5龄幼虫2、6、24 h都可诱导SeKr-h1表达，并且在处理6 h时的诱导效果最为明显，为对照的8.76倍;Methoprene处理化蛹末期的雌蛹，试验组羽化12 h雌虫SeKr-h1表达量为对照组的3.34倍。本研究克隆得到SeKr-h1α完整编码序列，并明确SeKr-h1的表达特性及其对JH类似物存在诱导响应，为进一步深入研究甜菜夜蛾SeKr-h1基因功能以及开发防控新策略奠定了良好基础。

关键词：甜菜夜蛾;SeKr-h1;基因克隆;表达特性;JH类似物

中图分类号：S433.4 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）24-0114-07

收稿日期：2021-04-21

基金项目：国家自然科学基金（编号：31901889）;国家重点研发计划（编号：2017YDF0201900）;国家农业产业技术体系建设专项（编号：CARS-15-19）。

作者简介：赵 静（1989—），女，江苏宜兴人，博士，助理研究员，主要从事经作虫害防控研究工作。E-mail：jingzhao0126@126.com。

通信作者：肖留斌，硕士，研究员，主要从事经济作物害虫防控研究工作。E-mail：xlbwll@sohu.com。

甜菜夜蛾[Spodoptera exigua （Hǜbner）]是一种世界性分布、间歇性发生的杂食性害虫，危害棉花、蔬菜等多种作物[1-2]。近年来，随着转基因棉种植面积扩大，棉田生物群落结构与功能发生了相应的变化。原本为次要害虫的甜菜夜蛾在棉花上的发生日益严重，逐渐成为危害棉花生产的主要鳞翅目害虫[3-4]。同时，甜菜夜蛾已对氯虫苯甲酰胺、茚虫威等多种杀虫剂产生较高的抗药性，亟需开拓新的防控靶标[5]。甜菜夜蛾一生经历卵—幼虫—蛹—成虫的变化过程，开展影响甜菜夜蛾变态发育关键基因的研究，对于发展甜菜夜蛾新的防控手段具有重要意义。

保幼激素（juvenile hormone，JH）和蜕皮激素（ecdysteroids，20E）是参与调控昆虫蜕皮和变态发育最重要的2种激素[6-7]。近年来随着分子生物学的发展，保幼激素调控昆虫变态发育的分子机制取得了较大的进展，JH主要受体蛋白met及多个下游响应基因相继被鉴定[8]。Krüppel homolog 1（Kr-h1）是一种含有8个锌指结构（C2—H2）的转录因子，在家蚕（Bombyx mori）、麦红吸浆虫（Sitodiplosis mosellana）等昆虫中，Kr-h1被证实是保幼激素早期响应基因[9-11]。用JH类似物Methoprene点滴或注射家蚕4、5龄幼虫，发现JH能诱导家蚕体内BmKr-h1的表达上调[9-10]。JHⅢ对麦红吸浆虫滞育幼虫有剂量依赖性的诱导作用。用0.1～0.3 pg/nL Methoprene注射滞育幼虫6 h，Kr-h1表达量随着浓度升高而增加[11]。目前，NCBI上已登录有20多种昆虫的Kr-h1基因序列，大多数昆虫的Kr-h1只有1个转录产物，但是在果蝇（Drosophila melanogaster）和家蚕中除外，果蝇存在3种可变剪接的转录产物，分别为Kr-h1α、Kr-h1β、Kr-hλ;而家蚕BmKr-h1有BmKr-h1α和BmKr-h1β共2种转录产物，BmKr-h1α蛋白比BmKr-h1β蛋白在N端多了十几个氨基酸[9，12]。

在不同昆虫中，Kr-h1被证实参与变态发育、生殖生理等过程[13]。赤拟谷盗（Tribolium castaneum）幼虫末期TcKr-h1短暂高表达对蛹的形成非常重要。干扰幼虫末期TcKr-h1瞬时高表达，会引起E93的表达上调，从而引起虫体直接跳过蛹期到达成虫期[14]。在飞蝗（Locusta migratoria）、大猿叶甲（Colaphellus bowringi）等昆虫中，施用JH类似物促进Met及Kr-h1的转录，进而促进与生殖相关的卵黄原蛋白Vg/卵黄原蛋白受体VgR基因表达，最终影响卵巢发育与成熟[15-16]。除了调控昆虫生长发育与生殖，在蜜蜂（Apis mellifera）及果蝇中，Kr-h1还能影响觅食行为以及神经元细胞形成[17-18]。

Kr-h1是参与昆虫变态发育的关键基因。目前，在NCBI 上仅登录甜菜夜蛾SeKr-h1β（S. exigua Krüppel homolog 1β）序列，但对于甜菜夜蛾SeKr-h1的分子特性、表达模式及对JH响应机制还未有报道。基于实验室前期测得的甜菜夜蛾转录组数据，笔者检测到甜菜夜蛾SeKr-h1还存在另一个转录本SeKr-h1α。本研究利用RT-PCR技术，对甜菜夜蛾的SeKr-h1α基因进行了克隆、测序和基本的生物信息学分析，同时通过qPCR技术明确了SeKr-h1α/β在不同发育阶段的表达特性以及对JH存在诱导响应表达，为进一步研究甜菜夜蛾SeKr-h1基因的功能以及基于SeKr-h1基因開发害虫防控手段奠定良好的基础。

1 材料與方法

试验于2020 年在江苏省农业科学院植物保护研究所完成。

1.1 试验材料

供试甜菜夜蛾虫源采自江苏省南京市江宁区的郊区，于江苏省农业科学院植物保护研究所养虫室用人工饲料对其继代培养。甜菜夜蛾饲养条件为温度（25.5±1） ℃，相对湿度（65±5）%，光—暗周期14 h—10 h，成虫期补充10%蜂蜜水。

1.2 方法

1.2.1 甜菜夜蛾SeKr-h1α基因的克隆

采用Trizol法提取甜菜夜蛾雌成虫的RNA，并反转录为cDNA。将羽化1 d甜菜夜蛾虫体放入研钵中，加入少量的液氮，将虫体充分研磨至粉末状，收集 0.05～0.1 g组织量至离心管并加入1 mL的Trizol试剂，按照试剂说明书提取总RNA。通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带完整性，并用紫外可见分光光度计确定RNA质量和浓度。通过M-MLV反转录酶体系对样品RNA进行反转录，所得cDNA于-20 ℃冰箱中保存，备用。

基于测得的甜菜夜蛾转录组序列，设计引物通过RT-PCR扩增SeKr-h1α的全长，引物序列见表1。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段产物，回收鉴定正确的产物并连接pClone007载体，室温（22～30 ℃）反应5 min，将连接产物转化DH5α感受态细胞，最后通过菌落PCR筛选阳性转化子，并送上海生物工程有限公司测序。

1.2.2 甜菜夜蛾SeKr-h1α序列结构分析及系统进化树的构建

为验证克隆得到的SeKr-h1α序列的可靠性，利用NCBI的Blast工具将其与GenBank数据库中的其他物种进行同源性序列比对。采用DNAMAN 6.0软件预测SeKr-h1α蛋白分子量和等电点。采用 NCBI的CCD软件进行SeKr-h1α功能结构域预测。用Signal 3.0在线软件对SeKr-h1α进行信号肽分析。利用 NetPhos及 NetGlycate在线软件对其进行磷酸化位点预测和糖基化分析。使用Clustal W 软件对鳞翅目Kr-h1氨基酸序列进行比对。采用MEGA 5软件NJ法构建昆虫Kr-h1系统发育树。

1.2.3 甜菜夜蛾不同发育阶段SeKr-h1α/β的表达动态

收集甜菜夜蛾1～5龄幼虫，预蛹，化蛹1、3、7 d的雌、雄蛹，羽化1～3 d的雌、雄蛾，立即放置液氮中冷冻，-80 ℃保存以备提取RNA以及荧光定量qPCR试验。

根据甜菜夜蛾SeKr-h1α/β基因序列分别设计qPCR引物（SeKr-h1α：Krα-Q887F，Krα-Q1081R;SeKr-h1β：Krβ-30F，Krβ-179R），进行qPCR分析。引物序列见表1，以Actin为内参基因。用以TB Green 为染料的荧光标记法进行qPCR定量检测。20 μL qPCR体系：TaKaRa TB Green Premix Ex TaqTM 2 μL、引物各 0.4 μL、模板 cDNA 2 μL、ddH2O 7.2 μL。反应条件：95 ℃预变性 30 s;95 ℃变性5 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 10 s，共 40个循环。不同发育时期样品各3个生物学重复和4个技术重复，每个生物学重复取3头试虫。

1.2.4 SeKr-h1对保幼激素类似物诱导响应表达的qPCR检测

将保幼激素类似物Methoprene（Sigma，美国）通过丙酮稀释成5 μg/μL的母液，封存于-20 ℃。挑选健康的、大小一致的5龄3 d幼虫，并用无菌水清洗虫体表面的饲料，用滤纸吸干水分，通过微量注射仪点滴1 μL于幼虫的第2与第3胸节之间，并以丙酮作为对照。分别收集对照幼虫以及用Methoprene处理2、6、24 h的幼虫各4组，每组3头，用液氮快速冷冻虫体，保存于-80 ℃。

选取大小一致、体色发黑、化蛹7 d的甜菜夜蛾雌蛹，通过微量注射仪注射，每头蛹施用量为1 μL，以丙酮作为对照。将注射后的蛹放入玻璃缸中，为防羽化后飞出用纱布覆盖缸口并用橡皮筋扎紧。将玻璃缸置于恒温箱正常饲养，分别收集羽化12 h的雌成虫以及对照成虫各4组，每组3头。

按“1.2.1”节的方法将上述收集的样品提取RNA，并反转录成cDNA，利用qPCR检测JH类似物施用组和对照组SeKr-h1的表达情况。

1.3 数据分析

基因表达相对量的变化采用2-ΔΔCT法[19]表示，采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，并用Tukey’s HSD 法进行差异显著性检测。

2 结果与分析

2.1 SeKr-h1α基因克隆与序列特征

基于甜菜夜蛾的转录组序列，根据预测序列设计引物，通过RT-PCR扩增SeKr-h1α基因。在图1的电泳图中显示扩增得到1条1 000 bp左右的条带。序列分析显示，其完整编码序列全长1 068 bp，GC含量达到44.5%，编码 355个氨基酸，预测的MW分子量约为39.35 ku，等电点PI为8.93。用NetGlycate以及Signal 3.0在线软件对SeKr-h1α进行糖基化和信号肽分析，发现SeKr-h1α不含糖基化修饰位点和信号肽，暗示SeKr-h1α可能为一种无糖基化修饰的非分泌型蛋白。利用 NetPhos 软件对SeKr-h1α蛋白进行预测，结果显示，SeKr-h1α有37个磷酸化位点，分别为19个Ser、17个Thr 和1个Tyr。

2.2 SeKr-h1α氨基酸序列结构比对

与NCBI上已有的甜菜夜蛾Kr-h1氨基酸序列比对，发现本研究克隆的SeKr-h1 N端存在差异，缺少12个氨基酸，为Kr-h1α，NCBI的Kr-h1序列为Kr-h1β（图2-A）。鳞翅目不同物种 Kr-h1的氨基酸序列进行多序列比对结果（图2-B）显示，所有昆虫都有8个典型的锌指结构域。与比对的鳞翅目其他昆虫类似，SeKr-h1蛋白的C端还包含2个蛋白互作基序（LPPRKR 和SVIQFA）。对鳞翅目现有SeKr-h1氨基酸序列比较，除了SeKr-h1β，甜菜夜蛾SeKr-h1α与球菜夜蛾（Agrotis ispilon）最相似（92.11%），其次是棉铃虫（Helicoverpa armigera）（89.80%），梨小食心虫（Grapholita molesta）（86.04%）。

2.3 昆虫Kr-h1系统发育树分析

为了解不同昆虫Kr-h1蛋白之间的进化关系，以人类的Kr-h1为外群，基于14种昆虫的Kr-h1氨基酸序列构建系统发育树。从图3可以看出，SeKr-h1与同源自鳞翅目的棉铃虫以及球菜夜蛾Kr-h1亲缘关系最近，形成姐妹群。相比鞘翅目和膜翅目，鳞翅目与双翅目Kr-h1亲缘关系更近。

2.4 甜菜夜蛾不同发育时期SeKr-h1α/β表达趋势

通过荧光定量qPCR分析SeKr-h1α/β在甜菜夜蛾不同发育时期的表达情况，结果（图4）显示，SeKr-h1α/β表达趋势一致，SeKr-h1α为主要表达的转录产物。SeKr-h1α/β在1～4龄幼虫低表达，进入5龄后表达量上升，至预蛹阶段表达量达到峰值后开始下降，在蛹期维持低表达（图4-A）。SeKr-h1α/β在成虫期高表达，雌成虫表达量先上升后下降，在羽化1 d時达到峰值（图4-A）;雄成虫表达量稳步上升，在羽化3 d时达到最高（图4-B）。

2.5 甜菜夜蛾SeKr-h1对JH类似物的诱导响应

为进一步探究SeKr-h1对激素的诱导响应，用保幼激素类似物Methoprene点滴甜菜夜蛾5龄3 d幼虫和注射化蛹7 d的雌蛹（5 μg/头），于处理后不同时间取样检测SeKr-h1的表达水平。荧光定量qPCR 结果显示， Methoprene处理2、 6、24 h都可诱导5龄幼虫SeKr-h1的表达，并且在处理6 h时的诱导表达效果最好，为对照的8.76倍;处理2 h和24 h时，SeKr-h1表达量分别为对照的4.88倍和2倍（图5-A， P<0.05）。 用Methoprene处理化蛹末期的雌蛹，试验组羽化12 h雌虫SeKr-h1表达量为对照组的3.34倍（图5-B，P<0.05）。 该结果表明甜菜夜蛾SeKr-h1在幼虫期和成虫期受到JH的调控。

3 讨论

Kr-h1是JH的早期响应基因，近年来对昆虫Kr-h1的研究逐渐增多，根据NCBI上提供的信息，拥有完整8个锌指结构（Zn1～Zn8）的Kr-h1基因已超过20个。目前，克隆的大多数昆虫Kr-h1只有1个转录本，但家蚕和果蝇存在2种及以上转录本，其中共有的转录本为Kr-h1α及Kr-h1β，Kr-h1α蛋白比Kr-h1β蛋白在N端多了十几个氨基酸，Kr-h1α被认为参与了昆虫的变态发育过程[9，12]。依据甜菜夜蛾转录组数据库，同时借助 RT-PCR 技术，克隆扩增了SeKr-h1的开放阅读框序列，与NCBI上已有的甜菜夜蛾Kr-h1序列相比，N端氨基酸存在差异，缺少12个氨基酸，经鉴定为α蛋白。对不同鳞翅目昆虫Kr-h1蛋白的氨基酸结构进行比较，发现它们存在8个高度保守的锌指结构域。研究表明，Kr-h1通过保守的锌指结构结合靶基因的CACCC或GC等位点，进而调控靶基因[20]。锌指结构域的数量在大多数昆虫中为8个，但是在寄生类昆虫中存在缺失，如人头虱（Pediculus humanus）没有Zn7，丽蝇蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）的Kr-h1蛋白只有Zn4和Zn7[21]。寄生类昆虫Kr-h1 锌指蛋白个数的缺失推测可能与这2种昆虫锌指结构功能退化以及结构冗余性有关。

Kr-h1的表达具有发育时期特异性，在大多数昆虫的幼虫向蛹转变期以及成虫期高表达。家蚕BmKr-h1α/β在幼虫、蛹及成虫3个阶段都有表达，表达趋势一致，但BmKr-h1α表达丰度远高于BmKr-hβ。BmKr-h1α/β在家蚕5龄幼虫初期表达量极低，进入5龄末期表达量开始急剧上升然后下降，蛹期维持低表达，成虫期高表达[9]。梨小食心虫Kr-h1在幼虫期低表达，在预蛹期表达量先上升后下降，成虫期表达量稳步上升[22]。与家蚕类似，甜菜夜蛾SeKr-h1α为主要表达的蛋白形式，在预蛹期和成虫期高表达，可能参与幼虫向蛹及蛹向成虫转变的激素信号转导。在果蝇中，Kr-h1β主要在其胚胎发育时期的中枢神经表达，而Kr-h1α的表达则贯穿了幼虫的整个时期，在预蛹期的初期表达量较高，同时大部分缺少Kr-h1α的虫体会在变态时期死亡[12，23];除了参与变态发育，在其他昆虫中，Kr-h1表达模式还与幼虫滞育、觅食行为有关。麦吸虫Kr-h1 mRNA丰度随着幼虫进入3龄早期、滞育前期和维持期而增加，并在滞育后静止期达到峰值[24]。Kr-h1在蜜蜂大脑中的表达受cGMP调控，其启动子包含一个保守的潜在cGMP反应元件，与觅食行为密切相关[17]。

JH在全变态或半变态昆虫未成熟期过渡到成虫阶段的过程中发挥了重要的作用[21，25]。Kr-h1被证实参与调控昆虫JH信号的传导而发挥变态发育、生殖生理等功能。用JH类似物处理果蝇及家蚕等昆虫，会促进Kr-h1的转录表达，导致幼虫延迟化蛹并降低20E滴度[26-27]。在赤拟谷盗、果蝇及德国小蠊（Blattella germanica）幼虫期干扰Kr-h1的表达，会引起虫体的早熟[14，26-28]。对褐飞虱3龄若虫注射kr-h1 dsRNA，会导致翅膀发育不良和雌雄成虫外生殖器畸形[29]。在飞蝗、大猿叶甲等昆虫中，JH通过其受体Met促进Kr-h1的转录，进而促进卵黄原蛋白Vg及其受体VgR的表达，最终影响卵巢发育[15-16]。对球菜夜蛾注射JH抑制剂以及JH类似物，证实Kr-h1受到JH的调控，并影响球菜夜蛾的性行为[30]。本研究对甜菜夜蛾幼虫和蛹体外施用JH类似物，其试验结果显示，SeKr-h1在幼虫和蛹末期都受到JH的诱导，但其响应机制以及发挥的生理功能仍需进一步的研究。

本研究通过RT-PCR技术克隆了SeKr-h1α的编码序列，明确了SeKr-h1α/β在幼虫向蛹转变期以及成虫期高表达，该表达特性可能与其调控变态发育、成虫生殖等功能有关。SeKr-h1的表达在幼虫和蛹末期都能响应JH类似物的诱导。该研究结果可为以JH信号传导通路基因为靶标研发新型害虫控制剂奠定良好的研究基础。

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