中国特有种苦绳(广义夹竹桃科)的大小孢子发生和雌雄配子体发育及其分类学意义

艾静 李璐 王艳萍 郭辉军

摘 要：  近年來的分子系统学把狭义萝藦科和狭义夹竹桃科合并为广义夹竹桃科，包括5个亚科和25个族，但亚科和族间的亲缘关系较为复杂，亟待多学科证据澄清。本文利用常规石蜡切片技术观察了马利筋亚科南山藤属中的中国特有植物苦绳（Dregea sinensis var. sinensis）的孢子发生和配子体发育，结合已有资料比较了5个亚科的胚胎学特征。结果表明：（1）苦绳的花药由一对侧生并列药室组成，各有一个花粉团。（2）花药壁有6层，由外至内分别为表皮、2层药室内壁、中层和2层绒毡层，花药壁发育模式属于多层型。（3）绒毡层细胞单核，排成2列，为腺质型;在小孢子四分体形成时期，药室内壁发生明显纤维状加厚;花药成熟时，位于药室远轴最外侧处的花药壁发生断裂，准备散粉。（4）小孢子母细胞减数分裂中，胞质分裂方式为连续型，小孢子四分体排列方式为左右对称;成熟花粉粒为3-细胞型，排列紧密，形成花粉团。（5）雌蕊含有两枚离生心皮，具边缘胎座，胚珠倒生，单珠被，薄珠心，蓼型胚囊。本文观察到的这些胚胎学特征为牛奶菜族提供了新资料。同时，胚胎学特征在5个亚科间的区别和联系，支持广义夹竹桃科的成立。

关键词： 广义夹竹桃科， 苦绳， 大小孢子发生， 雌雄配子体发育， 分类学意义

中图分类号：  Q949

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2021）12-2014-10

收稿日期：  2020-09-10

基金项目：  国家中医药管理局全国中药资源普查项目（GZY-KJS-2018-004）  [Supported by the Fourth National Survey on Chinese Material Medical Resources （GZY-KJS-2018-004 ）]。

作者简介： 艾静（1995-），硕士研究生，研究方向为水生植物，（E-mail）aijing95@foxmail.com。

通信作者：  李璐，博士，副研究员，研究方向为植物系统与进化，（E-mail）lilusaraca@foxmail.com。

Sporogenesis and gametogenesis in Chinese endemic plant of Dregea sinensis var. sinensis（Apocynaceae sensu lato） and their taxonomic insights

AI Jing1，2， LI Lu1*， WANG Yanping1，2， GUO Huijun2

（ 1. Department of Biodiversity Conservation， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China; 2. Department of Life Science， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China ）

Abstract：  Asclepiadaceae s. str. and Apocynaceae s. str. have been combined as a monotypic family of Apocynaceae s. l. based on molecular data， including 5 subfamilies and 25 tribes. However， the relationships between subfamilies and tribes are complicated and needed to be further clarified. Sporogenesis and gametogenesis in Chinese endemic plant of Dregea sinensis var. sinensis（trib. Marsdenieae， subfam. Asclepiadoideae）were investigated using paraffin sectioning， and then the observed embryological characters were compared with those of five subfamilies for taxonomic insights. The results were as follows： （1） The anther was comprised of two lateral thecae containing a pair of pollinia. （2） The developed anther wall consisted of six layers， including an epidermis， two layers of endothecium， a middle layer， and 2-layered tapetum. So， the anther wall development was of Massive type. （3） The tapetum was uni-nucleated，2-layered， and of glandular type. Endothecium developed fibrous thickenings heavily and a slit occurred at abaxial position of each theca when anther was ripened. （4） The microspore mother cells underwent meiosis with a successive cytokinesis and produced microspore tetrads with isobilateral arrangement. The microspores retained in tetrads developed into 3-celled pollens by mitosis twice， which formed a compact pollinium. （5） The pistil was composed of two separate carpels containing many anatropous， tenuinucellar， and unitegmic ovules with marginal parietal placentations. The development of embryo sac conformed to the Polygonum type. These embryological features observed added new data to the tribe Marsdenieae. It was confirmed that the recognition of a monophyletic Apocynaceae s. l. was supported by some distinguished and related embryological characters among five subfamilies.

Key words： Apocynaceae sensu lato， Dregea sinensis var. sinensis， sporogenesis， gametogenesis，  taxonomic significance

长期以来，萝藦科（Asclepiadaceae）和夹竹桃科（Apocynaceae） 的分类系统备受人们关注，面临着独立或合并的分类学争论。早在1810年，Robert Brown把夹竹桃亚目（Apocineae）中包含的萝藦类成员（asclepidads）分离出来，创建了萝藦科。在此后的200多年里，植物系统学家根据形态学接受了夹竹桃科和萝藦科的分类概念，认为两个科的亲缘关系较近（蒋英和李秉涛，1977;Cronquist， 1981; Li et al.， 1995）。不过，近20多年来，分子系统学研究（Sennblad & Bremer， 1996; Endress et al.，1996; Endress & Bruyns， 2000; Potgieter & Albert， 2001， 2014）认为，这两个科都不是单系，但合并在一起就构成稳定的单系，可以处理为包含5个亚科、25个族和366属的广义夹竹桃科（Apocynaceae sensu lato） （Endress et al.， 2014）。其中，有3個亚科来自狭义萝藦科（Asclepidaceae sensu stricto），包括马利筋亚科（Asclepiadoideae）、鲫鱼藤亚科（Secamonoideae）、杠柳亚科（Periplocoideae）;另外2个亚科来自狭义夹竹桃科（Apocynaceae s. str.），即夹竹桃亚科（Apocynoideae）和萝芙木亚科（Rauvolfioideae ）（表1）。

然而，由于分子系统研究中涉及到的取样范围的覆盖面和代表性问题（Endress et al.， 2014），广义夹竹桃科内亚科、族、亚族和属级的亲缘关系尚不明确，需要更多学科证据来澄清（Liede et al.， 2000; Simes et al.， 2004; Goyder et al.， 2007; Lahaye et al.， 2007; Livshultz， 2010; Nazar et al.， 2019）。重建一个合理的植物分类系统的最好方法是把形态学和分子生物学证据紧密结合起来（Endress et al.， 2014）。近年来的形态学研究为广义夹竹桃科内尚未解决的属级分类学问题提供了新证据，包括木材形态解剖学 （Lens et al.， 2008， 2009）、花部结构（Liede & Kunze， 1993; Kunze， 1996， 2005; Wanntorp & Kunze， 2009; Nam & Chung， 2019; El-Fiki et al.， 2019）和花粉形态 （Venter & Verhoeven， 2001; Güven et al.， 2015）。现有资料表明，狭义夹竹桃科和狭义萝藦科的胚胎学特征在亚科、族和属间变化多样，具有明显的分类学意义（Maheshwari， 1964; Mulay et al.， 1965; Davis， 1966;Lakshminariayana， 1989; Jhori et al.， 1992; 王定康等，2011;刘鹏等， 2016）。

南山藤属（Dregea Mey. ）是狭义萝藦科马利筋亚科牛奶菜族（trib. Marsdenieae）中一类多年生攀援藤本，包括12种，分布于亚洲和非洲，我国有4种及4变种，集中分布在南部（蒋英和李秉涛，1977;Li et al.， 1995）。除南山藤（D. volubilis）外，其余3种及4变种都为中国特有种，包括生长在我国南方亚热带山地的苦绳（D. sinensis）。苦绳富含多种活性成分（金岐端和木全章，1989;Wei et al.， 2020），全株药用，幼嫩花蕾在我国滇中地区可食。它有2个变种：原变种苦绳（D. sinensis var. sinensis）和变种贯筋藤（D. sinensis  var. corrugata）。本研究利用常规石蜡切片技术观察了苦绳的大小孢子发生和雌雄配子体发育，为广义夹竹桃科的系统分类补充胚胎学资料，也为进一步合理开发利用苦绳野生资源提供繁殖生物学基础。

1 材料与方法

研究材料取自云南省澄江市（103°01′43.03″ E、24°42′21.15″ N;澄江市中药资源普查采集的凭证标本号：5304220329，存于西南林业大学标本馆）。在2019年3—4月，采集不同发育时期的花蕾和已开放的花，固定并保存于FAA固定液（甲醛∶冰醋酸∶50% 酒精=4∶6∶90）。常规石蜡切片（厚度为7～12 μm），铁矾-苏木精染色，树脂封片，Nikon E600显微镜下观察拍照，Photoshop CS 6.0制作图版。

2 结果与分析

2.1 苦绳的花药壁发育

苦绳花具5枚雄蕊，每个花药具一对侧生并列花药室（图版Ⅰ： 1）。小孢子母细胞时期，花药壁发育完全，由外到内共有6层，分别为表皮、2层药室内壁、中层和2层绒毡层（图版Ⅰ： 2），花药壁发育类型为多层型（Massive type）（Sood， 1989）。此时，表皮细胞不发达，细窄;2层药室内壁细胞分化不成熟，排列不整齐;中层细胞长条形，2层绒毡层细胞较发达（图版Ⅰ： 2）。小孢子母细胞进入减数分裂Ⅰ时期，表皮细胞保持细长形轮廓;2层药室内壁细胞体积增大，呈阔方形;中层细胞核明显，继而变窄开始降解;绒毡层细胞最发达，呈圆球形，细胞核明显，为单核（图版Ⅰ： 3，4）。小孢子母细胞减数分裂Ⅱ时期，表皮细胞轮廓明显;2层药室内壁细胞进一步分化为长方形，且外层比内层细胞较大，均出现了不同程度的纤维状加厚;中层和绒毡层细胞进一步降解（图版Ⅰ： 5-6）。小孢子四分体形成时期，表皮细胞开始齿状退化，药室内壁细胞径向纤维状加厚加剧;中层和绒毡层逐步退化，仅留残迹（图版Ⅰ： 7-10）。雄配子体发育过程中，花药壁在花药室远轴端一侧逐步降解变细（图版Ⅰ： 11，12）;到3-细胞型花粉时期，花药壁发生断裂，形成花粉裂口，露出排列紧密的花粉团，准备散粉（图版Ⅰ： 13，14）。

2.2 苦绳的小孢子发生及雄配子体发育

早期花药发育阶段，花药纵切面上，小孢子母细胞排列紧密，呈不规则长矩形（图版Ⅱ：1），小孢子母细胞减数分裂Ⅰ后期，形成两个子核（图版Ⅱ： 2），接着出现明显的子细胞壁，产生了小孢子二分体（图版Ⅱ： 3）。小孢子母细胞减数分裂Ⅱ时期，二分体细胞继续分裂，各自形成2个子核（图版Ⅰ： 4），逐渐移向两极，同时子细胞壁分化明显，发育为小孢子四分体（图版Ⅱ：5，6），在花药横切面上呈左右对称，排列紧密（图版Ⅱ： 6，7）。因此，小孢子发生的胞质分裂方式为连续型。接着，小孢子继续保持在四分体内完成第一次有丝分裂，产生了两个子细胞（图版Ⅱ： 8）。其中，一个子细胞分化为营养细胞，另一个子细胞继续分裂形成两个精细胞，发育为3-细胞型花粉（图版Ⅱ： 9，10）。3-细胞型花粉继续保持在四分体内，形成四合花粉。四合花粉紧密排列，发育为一长棒状花粉团，其横切面为短椭圆形（图版Ⅱ： 11），纵切面为长椭圆形（图版Ⅱ： 12）。

2.3 苦绳的大孢子发生和雌配子体发育

通过子房横切面，可以观察到苦绳的雌蕊有两枚离生心皮，每个心皮的边缘胎座着生着数枚倒生胚珠（图版Ⅲ：1）。发育早期，紧密排列的胚珠原基呈直立生长，珠心表皮细胞下的一个孢原细胞直接发育为大孢子母细胞，其细胞轮廓明显增大，液泡化显著，准备进入减数分裂（图版Ⅲ：2），因此，苦繩的胚珠为薄珠心。大孢子母细胞通过减数分裂I形成了大孢子二分体（图版Ⅲ：3），通过减数分裂Ⅱ，产生了排成一条直线的大孢子四分体（图版Ⅲ：4）。发育过程中，靠珠孔端的3个大孢子退化，近合点端的一个大孢子分化为功能大孢子母细胞（图版Ⅲ：5）。此时，胚珠的生长方向由早期的直立生长发生了倒转，导致珠孔方向和珠柄端非常接近（图版Ⅲ：6，8，11），形成倒生胚珠。接着，功能大孢子母细胞（图版Ⅲ：6），通过三次有丝分裂，相继发育为2核-（图版Ⅲ：7）、4核-（图版Ⅲ：9，10）和8核-雌配子体（图版Ⅲ：11-13）。8核-雌配子体中，中央的两个极核靠拢形成2核-中央细胞，珠孔端的2个助细胞和一个卵细胞构成卵器，合点端的3个反足细胞排成一条线并退化成残迹（图版Ⅲ：14-16），完成了成熟雌配子体的发育，其发育过程符合蓼型（Polygonum type）。

3 讨论与结论

本文首次揭示了苦绳的大小孢子发生和雌雄配子体发育过程，具有以下10个显著的分类学特征：（1）花药2室，各有一枚花粉团;（2）花药壁有6层，发育模式符合多层型;（3）表皮和中层细胞不发达，早退;（4）药室内壁细胞发达，有2层，径向延伸增大且发生明显的纤维状加厚;（5）绒毡层单核， 排成2列，腺质型;（6）花药成熟时，花药壁靠药室远轴端开裂，释放花粉团;（7）小孢子母细胞经连续型胞质分裂形成左右对称形排列方式;（8）成熟花粉为3-细胞型;（9）3-细胞型花粉两两紧密排列，构成花粉团;（10）雌蕊由两枚离生心皮组成，具边缘胎座、倒生胚珠、薄珠心、单珠被和蓼型胚囊。

为更好地理解苦绳的胚胎发育特征的分类学意义， 本文把观察到的胚胎学特征和广义夹竹桃科5个亚科现有的胚胎学资料 （Mulay et al.， 1965; Davis， 1966; Maheshwari， 1971; Maheshwari & Lakshminariayana， 1977; Lakshminariayana， 1989; Jhori et al.， 1992; 王定康等，2011;刘鹏等，2016）进行了比较胚胎学研究（表1），探讨了它们的分类学意义，结果如下。

3.1 花药室结构特征

苦绳的每枚雄蕊具2个花药室，每个花药室产生1个花粉团，这与马利筋亚科其他成员一致（Johri et al.， 1992）。雄蕊的花药室数目和散粉单元类型在5个亚科的分类系统中具有重要作用。传统分类学认为，狭义萝藦科和狭义夹竹桃科的区别在于，前者具有2室花药和花粉团，后者为4室花药和单花粉粒（Johri et al.， 1992; Li et al.，1995）。然而，在狭义萝藦科的3个亚科中，花药室数目和散粉单元特征既相互区别，又各有联系。例如，马利筋亚科有2个药室，具花粉团;但鲫鱼藤亚科和杠柳亚科都具4个药室，但前者有花粉团，后者为四合花粉。因此，根据花药室数目和散粉单元类型在3个亚科间的相互联系，支持狭义萝藦科并非单系的观点（Sennblad & Bremer， 1996; Endress & Bruyns， 2000）。此外，由于杠柳亚科和狭义夹竹桃科的2个亚科皆具4个药室和花粉粒的共同特征，因此支持它们具有较近的亲缘关系（Sennblad & Bremer， 1996; Endress et al.， 1996， 2014）。

3.2 花药壁发育类型

苦绳的花药壁由6层细胞组成，包括表皮、2层药室内壁、中层和2层绒毡层，其发育过程与被子植物现有记载的4种花药壁发育类型（Davis，1966; Johri et al.， 1992）不相符合，但与部分兰科所报道的多层型花药壁特征一致（Sood， 1989; 胡适宜等， 1992;Kant， 2011; Kant et al.， 2013; 张锦等，2019）。多层型花药壁是指由于药室内壁、或中层、或绒毡层的细胞层数分别增至2 ～ 3层以上，构成了6 ～ 7层以上的新拟花药壁类型，其正式描述和命名出现在兰科的羊耳蒜属（Liparis Rich） （Sood， 1989）。一方面，6层以上的花药壁在狭义萝藦科和狭义夹竹桃科均有记载，但尚未有研究将其归纳为多层型（Johri et al.， 1992）。例如，狭义萝藦科的3个亚科中，花药壁普遍为6 ～ 7层。另一方面，狭义夹竹桃科2个亚科的花药壁常被描述为5层，属于基本型（Johri et al.，1992），但萝芙木亚科马岭果属（Voacanga）的花药壁多为8 ～ 9层，在V. foetida可多达12 ～ 16层 （Maheshwari， 1971），显然应该属于多层型。因此，广义夹竹桃科的花药壁发育类型既有基本型，也有多层型。此外，多层花药壁特征在其他被子植物中也有记录，例如小檗科的南方山荷叶（Diphylleia sinensis）由于具有2层中层和2层绒毡层，花药壁多达7层，也符合多层型的范畴，但被判断为基本型（黄衡宇等，2010），值得进一步研究。

苦绳的药室内壁纤维性加厚明显，与马利筋亚科的相同。研究表明，广义夹竹桃科的5个亚科普遍具有药室内壁细胞发达，纤维性加厚明显的特征（Davis， 1966;Johri et al.， 1992），但部分成员的药室内壁纤维状加厚不明显或缺乏。例如：马利筋亚科的牛角瓜属（Calotropis） （Maheshwari，1964）和尖槐藤属（Oxystelma） （Maheshwari， 1964; Mulay et al.，1965），萝芙木亚科的海芒果属的Cerbera odollam 和夹竹桃亚科的纽子花属的Vallaris solanacea（Anantaswamy， 1940）。由于药室内壁纤维性加厚有助于花药开裂散粉（Johri et al.， 1992），所以，花药壁缺乏纤维性加厚的类群，其花药开裂的方式有待于继续研究。

苦绳的绒毡层细胞具有单核双列的特征，与马利筋亚科的部分成员相符，但与其他4个亚科的单核单列截然不同，后者在被子植物中比较普遍（Johri et al.， 1992）。相比较而言，马利筋亚科的绒毡层细胞特征变化较大，有3种类型：单核多列、多核单列和多核多列。单核多列见于青羊参（Cynanchum callialatum）、Pergularia daemia以及Tylophora indica（Maheshwari，1964），苦绳的单核双列也属于该类型。多核单列见于Leptadenia reticulata和Pentatropis sprialis （Mulay et al.，1965）。多核多列见于尖槐藤属（Maheshwari， 1977）。因此，绒毡层细胞特征在马利筋亚科中变化较大，在族级水平具有一定的分类学意义。

3.3 小孢子发生和雄配子体发育

苦绳的小孢子发生的胞质分裂方式为连续型。在被子植物中，小孢子母细胞减数分裂的胞质分裂方式既有同时型，又有连续型，前者主要见于双子叶植物，后者普遍出现在单子叶植物，两种类型出现在同一个科的不同属也有报道，但属罕见（Johri et al.， 1992）。有意思的是，这些现象在5个亚科中均集中出现。5个亚科普遍具有同时型胞质分裂， 但在部分亚科中还存在着连续型。例如：马利筋亚科的青羊参属（Maheshwari， 1964;王定康，2011;）、牛角瓜屬（刘鹏等，2016）、翅槐藤属（Oxystelma）（Maheshwari， 1964）以及本文观察到的苦绳。此外，连续型还见于萝芙木亚科的罗布麻属的Apocynum androsaefolium、止泻木属的Holarrhena antidysenterica （Latto， 1974）和鸡蛋花属（Plumeria）（Chauhan， 1979）。值得注意的是，萝芙木亚科的一些物种存在两种类型兼有的罕见现象，如长春花属的Catharanthus pusillus （Bhasin， 1971）和萝芙木属的Rauvolfia canescens（Meyer， 1938）。狭义萝藦科和狭义夹竹桃科均同时存在两种胞质分裂方式，为广义夹竹桃科的确定提供了胚胎学证据。此外，萝芙木亚科存在同一个物种兼具两种胞质分裂方式在被子植物中较为少见，值得深入研究。

苦绳的小孢子四分体的排列形式多为左右对称，与5个亚科的大部分成员相似。同时，在夹竹桃亚科的止泻木 （Holarrhena pubescens）中，除上述3种四分体外，还观察到线型和T-型排列（Latto，1974）。现有研究表明（Nadot et al.， 2008），被子植物的基部类群和单子叶植物中小孢子发生的胞质分裂方式和小孢子四分体的排列形式有一定联系，表现为连续型胞质分裂产生的小孢子四分体只有四边形（或十字交叉型，T型，线型），但同时型的小孢子四分体的排列形式更多样化，既有四边形，也有正四面体型和菱形。因此，广义夹竹桃科的小孢子四分体的多样化的排列及其发育方式，值得重视。

苦绳的小孢子经过两次有丝分裂，发育为3-细胞型花粉，准备散粉，这和狭义萝藦科的3个亚科一致（Johri et al.，1992）。然而，在狭义夹竹桃科的2个亚科中，除3-细胞型花粉外，还有2-细胞型花粉。例如：萝芙木亚科的长春花属 （Bhasin， 1971）和夹竹桃亚科的止泻木属（Latto， 1974）与鸡蛋花属 （Chauhan， 1979）。一方面，早期研究表明（Brewbaker et al.， 1967; Webster et al.，1982），70%的被子植物具有2-细胞型花粉，在进化上比较原始;其余少数类群表现为3-细胞型花粉，演化程度较高，见于水生植物、禾本科和部分草本植物，且被认为是短命植物对环境的适应性演化。另一方面，近期研究表明，在部分被子植物基部类群和木本植物中，同科、同属，甚至同一个种的类群里，曾出现了2-细胞型和3-细胞型花粉的共存现象，如大戟科（Euphorbiaceae）（Webster et al.1982）、番荔枝科（Annonaceae） （Lora et al.，2009， 2012;Gan & Xu， 2018）、木兰科（Magnoliaceae）、腊梅科（Calycanthaecae）以及Monimiaceae （Johri et al.，1992）。因此，5个亚科具有2-细胞型和3-细胞型花粉的共存现象为广义夹竹桃科的确立提供了佐证。

3.4 胚珠和雌配子体发育

苦绳的雌蕊由2枚离生心皮组成，具边缘胎座、倒生胚珠、薄珠心、单珠被和蓼型胚囊等特征，与5个亚科的大部分胚胎学特征一致（Johri et al.， 1992）。在部分夹竹桃亚科和萝芙木亚科中，也存在着合生心皮（蒋英和李秉涛，1977; Li et al.， 1995）、半倒生和直立胚珠等特征（Johri et al.，1992）。

综上所述，苦绳的大小孢子发生和雌雄配子体发育过程补充了牛奶菜族的胚胎学资料。同时，比较胚胎学表明5个亚科的花药发育特征既相互区别又相互联系，不仅支持广义夹竹桃科的确立，也反映出该科花药发育特征的多样性。

致谢 论文撰写得到鲁东大学孔冬瑞博士和中国科学院昆明植物研究所彭华研究员的帮助，西南林业大学大型仪器共享平台提供实验设备。

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（责任编辑 李 莉）