益生元、益生菌微生态制剂对发酵乳发酵特性的影响

柴振宇，苑丽园，周晓梅，田木，江飞鸿，赵旭瑞

（1.吉林师范大学 博达学院，吉林 四平136000；2.东北农业大学，哈尔滨150030；3.吉林农业大学，长春130118）

0 引言

近年来，人们研究发现了微生态制剂高效、无药物残留、不产生耐药性的特点，并广泛应用于饲料加工、疾病治疗与畜牧养殖业中。

微生态制剂具有激活机体免疫反应，恢复微生态平衡，从而达到治疗疾病的目的[1]。其主要包括乳酸菌制剂，酵母菌制剂以及枯草芽孢杆菌制剂等，但每种制剂的功效比较单一。

益生元（Prebiotics）不能直接对机体起作用，而是通过益生菌发挥生理功能[2]。“益生元+益生菌”被称为合生元，其产品机理为：益生元向益生菌提供营养，肠道内的有益菌能够将其分解、消化、吸收，并促进有益菌的生长繁殖[3]。益生元能够调节机体免疫功能[4]，具有降血压、降血糖[5]，延缓衰老[6]等生理功能。姬松茸多糖是常见的益生元，能抑制肿瘤细胞的生长，对致癌物质有吸收、排泄的作用，对机体还能起到抗氧化、抗辐射、免疫调节、抗病毒和降血糖[8]的作用。

考虑已有研究[7]，选取德氏乳杆菌保加利亚种（Lactobacillus bulgaricussubsp.bulgaricus）和 嗜 热 链 球 菌（Streptococcus thermophiles）的混合菌株作为发酵乳发酵剂，并以此为对照组的发酵剂；试验组将姬松茸多糖和对照组的复合菌株经低温喷雾干燥技术制备的复合微生态制剂作为发酵乳发酵剂。通过两组相关理化性质和微生物指标相对比，观察两种发酵剂对发酵乳发酵特性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料乳，购于当地奶农，脂肪为3.60%，蛋白质为3.10%，抗生素检测阴性；姬松茸多糖，杭州雪域生物技术有限公司提供；发酵乳发酵剂，实验室制备，德氏乳杆菌保加利亚种(Lactobacillus bulgaricussubsp.bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus Thermophilus)的复合菌种。

PHS-3Cp H计，上海精科有限公司；PH-070A培养箱，上海一恒科学仪器公司；DV-Ⅲ黏度计，美国BROOKFIELD公司；电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司；高速离心机，上海佑科仪器仪表有限公司；磁力搅拌器，金坛市大地自动化仪器厂；无菌超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司。

1.2 实验试剂

氢氧化钠、酚酞、硫酸、无水乙醇、甲基红、溴甲酚绿购自四平市腾飞化学试剂商店；邻苯二甲酸氢钾，混合磷酸盐，硼砂购自天津北辰方正试剂厂；硫酸铜，异戊醇购自天津大茂化学试剂厂；氯化钠、营养琼脂培养基、孟加拉红培养基、MRS(Man Rogosa Sharpe)培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；氯化钠胰酪胨大豆肉汤、血琼脂平板、7.5%氯化钠肉汤、Baind-Parker琼脂平板、脑心浸出液肉汤（BHI）、兔血浆、磷酸盐缓冲液、缓冲蛋白胨（BPW）、四硫酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硫酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、沙门氏菌显色培养基、生化鉴定试剂盒购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.3 发酵乳的制备

发酵乳制备流程如下。

1.3.1 原料混合

准确称取7%的白砂糖加入到检验合格的原料乳中，充分混合后，经200目的过滤网进行过滤。

1.3.2 原料预热

原料乳与白砂糖的混合物预热到50～65℃，在此温度下，乳脂肪成熔融状态，脂肪球膜软化，有利于提高均质效果。

1.3.3 均质

均质可以使原料充分混匀，防止奶油上浮，保证乳脂肪均匀分布，有利于提高酸奶的稳定性，使酸奶质地细腻，口感更好，压力采用20～25 MPa，温度50～65℃。

1.3.4 热处理

热处理的主要目的是杀灭原料乳中的杂菌，确保益生菌的正常生长和繁殖。热处理使原料乳中的乳清蛋白变性，达到改善组织状态，提高黏稠度和防止成品乳清析出的目的。本实验原料乳采用的热处理参数为85℃，15 min。

1.3.5 冷却

热处理后的乳迅速降温到发酵剂菌种的最适生长温度，根据本实验室发酵剂的特性，把热处理后的乳迅速降温到43±1℃。

1.3.6 接种

事先将发酵剂在无菌操作条件下搅拌成均匀细腻的状态，不应存在大的凝块，以免影响成品质量。在冷却到43±1℃的乳中接种0.03%的发酵剂，试验组的发酵剂为姬松茸多糖与德氏乳杆菌保加利亚种(Lactobacillus bulgaricussubsp.bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus Thermophilus)制备的合生元复合微生态制剂，对照组为德氏乳杆菌保加利亚种(Lactobacillus bulgaricussubsp.bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus Thermophilus)的复合菌种。

接种时要严格注意操作卫生，防止细菌、霉菌、酵母菌、噬菌体以及其他有害微生物的污染。发酵剂加入后要充分搅拌，使发酵剂与原料乳混合均匀。

1.3.7 发酵

发酵乳制品在43℃发酵4～5 h。在此过程中要准确控制温度，保证温度恒定，避免忽高忽低；避免震动带来的组织状态不良，掌握好发酵时间，防止酸度不够或过度以及乳清析出。

1.3.8 冷藏后熟

待发酵乳制品达到凝固状态即可终止发酵，一般发酵终点可以根据pH值达到4.6或者滴定酸度达到70 °T来判断。

发酵好的凝固酸奶立即移入到4℃冰柜中，迅速抑制乳酸菌的生长，以免继续发酵造成酸度升高。在冷藏后熟期酸度仍会上升，同时风味成分双乙酰含量增加，风味物质继续产生，多种风味物质相互平衡形成酸乳的特征风味。

1.4 产品的感官

酸奶完全凝固，呈乳白色或微黄色，表面光滑、无乳清析出、具有酸奶的风味、酸甜适中、口感光滑细腻。

1.5 发酵乳各项指标的检测

依据GB5413.3-2010《婴幼儿食品和乳制品中脂肪的测定》、GB5413.34-2010《乳和乳制品酸度的测定》、GB5009.5-2010《食品中蛋白质的测定方法》、GB4789.18-2010《食品微生物学检验与乳制品检验》中要求的方法检测。

1.5.1 储藏期内发酵乳乳酸菌总数的测定

1.5.1.1 检验程序

检验程序如下。

1.5.1.2 操作步骤

配制MRS-IM琼脂培养基，按照国标方法进行乳酸菌计数[9]。每隔7 d检测一次活菌总数。

具体操作步骤如下：以无菌操作的方法取25 g发酵乳样品置于装有225 mL的无菌生理盐水的无菌均质袋中，充分混匀，进行10倍递增稀释。取2～3个适宜稀释度，各取1 mL加入无菌培养皿中，每个培养皿中加入配制好的MRS培养基15 mL，混匀凝固后，倒放在厌氧盒内。装有该样品的厌氧盒放入温度为36℃的恒温培养箱中，在此温度条件下培养72 h，培养后计数平板上的所有乳酸菌总数。

1.5.2 储藏期内发酵乳pH值的测定

pH值由pH计直接测量而得，每隔7 d检测一次发酵乳的pH值。

1.5.3 储藏期内发酵乳黏度的测定

黏度测量前首先将样品从4℃冰箱中取出，放置在室温环境下，待样品恢复至室温时开始测量。各参数设置如下：转子类型LV-4；测定转速200 r/min；测定时间1 min。检测频率每隔7 d检测一次。

1.5.4 储藏期内发酵乳持水力的测定

取待测发酵乳样品30 mL于离心管中，并测得样品的质量W0后，放入离心机中离心，以3 000 r/min离心20 min，取出离心管静置10 min后，去除上清液，测残余物的质量W，发酵乳的持水力计算公式如下：

持水力/%=W／W0×100%

2 发酵乳各项指标检测结果

2.1 储藏期内乳酸菌活菌总数检测结果

图1 显示的是储藏期4周内发酵乳中乳酸菌活菌总数的变化情况。从图1可以看出各试验组样品中的乳酸菌活菌数均多于对照组，说明添加姬松茸多糖的复合微生态制剂试验组对益生菌的生长产生了明显的促进作用，在4周28 d的储藏期内，试验组和对照组的活菌总数都达到了108以上，活菌总数较高，符合发酵乳制品食品安全国家标准GB 19302-2010中乳酸菌数≥1×106CFU/g(mL)的要求[10]。

图1 发酵乳中乳酸菌活菌数的变化

2.2 储藏期内pH值检测结果

图2 显示的是4周之内发酵乳样品的pH值的变化情况。在4周内，不管是试验组还是对照组的发酵乳样品的pH值均随时间延长而呈现下降趋势，但随着时间的变化，试验组和对照组的pH值均未发生显著性变化(P＞0.05)。4周货架期内，试验组发酵乳样品的pH值从4.50降到4.30，对照组发酵乳样品的pH值从4.55降到4.32，较小的变化表明发酵菌种在存贮期依然具有较好的产酸能力，并能产生少量的乳酸[11]。

图2 发酵乳中pH值的变化

2.3 储藏期内黏度检测结果

图3 显示的是储藏期4周内发酵乳的黏度变化情况。从图3可以看出，各组发酵乳样品的黏度与对照组相比，均发生了不同程度的增加。在整个贮存期间，随着时间的变化，黏度在整体上有显著性降低的趋势(P＜0.05)。发酵后，牛奶中蛋白酶继续催化分解凝胶结构中的蛋白质，使蛋白质交联被破坏，从而削弱了网络结构，致使发酵乳样品黏度有所降低。

图3 发酵乳中黏度的变化

2.4 储藏期内发酵乳持水力的变化

结果见图4。

图4 发酵乳贮藏期内持水力的变化

表1 发酵乳各项指标检测结果

图4 显示的是储藏期4周内发酵乳持水力的变化情况。从图4中可以看出，发酵乳的持水力在7 d内下降较快，第7天到第21天变化不明显，在贮藏期1～7 d内随着发酵乳的酸度的增大和pH值的降低，对发酵乳的凝胶结构影响较大，结构中所持的水分相对有较多的析出。第7～21 d随着酸度和pH值的变化，乳酸菌总数的减少对发酵乳的凝胶结构影响也逐渐减小。通过实验观察，虽然发酵乳在贮存期间由于酸度和pH值的变化对其持水力产生影响，但不管是对试验组还是对照组来说，始终未影响到发酵乳的整体凝胶效果。

2.5 发酵乳贮藏期内pH值与滴定酸度指标的变化

图5 显示的是储藏期4周内发酵乳的pH值和酸度指标的变化情况。发酵乳的酸度和pH值能够影响产品的质量和口感，发酵乳在4～6℃条件下贮藏1、3、7、15、21 d酸度和pH值的变化非常明显，从图5中可以看出，酸度反映了乳酸菌发酵产生乳酸的程度，酸度随着贮藏时间的延长而不断的增长，从第1天时酸度77 °T增长到了21天时的酸度91 °T，而pH值是发酵液的表观H+离子浓度，随着贮藏时间的延长pH值不断的下降，从第1天时pH4.50下降到第28天时pH4.30。可以得出结论，发酵乳贮藏时间越长酸度越高，pH值越低,两者之间有一定的相关性，但没有紧密联系的规律性可循。

图5 发酵乳贮藏期内pH值与酸度指标的变化

2.6 发酵乳感官状态的问卷调查结果

为了了解发酵乳样品的感官指标，我们进行了发酵乳样品的感官评价测试问卷调查。采用简单随机的抽样方法，抽取了本校不同专业的同学在现场进行试验组和对照组发酵乳样品的品尝，对回收的感官评价评分表共整理出95份有效调查表，分析其中的数据显示：试验组和对照组的发酵乳样品在口感、滋气味、组织状态、颜色等感官方面均优势明显，且两者在以上4个感官指标方面并无明显区别。

3 讨论

通过本试验发现，益生元对益生菌的影响作用重大[12]，益生菌添加益生元后制备的发酵乳与未添加益生元的发酵乳通过乳酸菌活菌总数、黏度、pH值检测、持水力检测、口感、滋气味、组织状态以及颜色等感官指标的检测结果可知，添加益生元后活菌总数增加，猜测可能原因是，姬松茸多糖由葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成[13]，单糖种类的多少可能影响乳杆菌的生长，从而影响发酵乳的活菌总数以及黏度值，但并不导致其感官指标发生差异性的变化。

表2 感官评定评分情况统计表

综上所述，添加益生元（姬松茸多糖）对发酵乳的发酵特性产生了影响，在4周储藏期内，试验组的乳酸菌活菌总数和黏度值均高于对照组，且符合发酵乳的国家标准要求，能够改善机体的免疫能力。