STK15、P15和MLH1肿瘤相关抗原自身抗体液体活检用于食管癌高危人群筛查研究

胡景峰，宋 昕，高社干，王 伟，3，李欣然，杨苗苗，徐瑞华，魏梦霞，韩文莉，雷玲玲，赵学科，孟超龙，胡守佳，程 锟,3，王盼盼，钟 侃，孔国强，王立东

食管癌预后较差，中晚期患者术后5 a生存率仅为10%左右[1]，而手术切除治疗的早期食管癌5 a生存率超过95%[1-2]。食管癌早期诊断和治疗可以极大地延长患者生存时间，但早期食管癌患者无特异症状，就诊时多已处于晚期，早期检出率不足2%[3]。食管癌高危人群预警筛查和早期发现是降低食管癌发病率和死亡率的关键[3]。肿瘤相关抗原是一种发展迅速的肿瘤标志物，是在恶性肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的或是由机体对肿瘤反应而异常产生和/或升高的，可以刺激机体产生自身抗体，反映肿瘤存在和生长的一类物质，为食管癌无创性液体活检技术的研发提供了重要检测指标[4-5]。利用检测肿瘤相关抗原自身抗体的液体活检技术筛查无症状高危人群和早期浸润食管癌是目前食管癌防治研究领域的重要研究课题之一[6-13]。本研究利用液体活检筛查技术，进行病例对照研究，并在高发区验证，评价液体活检技术在食管癌高危人群预警筛查和食管癌早期发现中的意义。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

研究对象分为3组人群。第一组为来自省部共建食管癌防治国家重点实验室200份血清样本，其中无任何肿瘤相关的证据正常人血清100份(正常组)，早期食管癌患者血清100份(食管癌组)。利用间接酶联免疫法对两组人群检测肿瘤相关抗原自身抗体STK15、P15和MLH1的表达情况。 第二组为在食管癌高发地区河南省新乡市某地做流行病学调查，对自愿接受血清学自身抗体检查和色素内镜检查的35岁无症状居民行相关检查。第三组为2014至2019年在食管癌高发地区河南省洛阳市某地食管癌筛查参与人群，对自愿接受血清学自身抗体检查的35岁以上无症状居民行相关检查。对血清学检查阳性者，经受试者同意后行色素内镜和黏膜病理检查。

1.2 实验方法

1.2.1 流行病学调查在当地政府人员和医生的帮助下，为当地居民讲解知情同意书，并帮助居民填写基本信息表。对自愿接受检查的受试者排除患有传染病、过敏及体质较差者。

1.2.2 血样采集与保存分别对每位受试者取空腹静脉血5 mL，置于离心管内，在室温下静置30 min后以2 000 r·min-1离心20 min，吸取血清，每管100 μL分装，干冰保存，限时转至实验室-80 ℃冰箱内储存备用。

1.2.3 自身抗体测定实验方法为本实验室已建立的间接酶联免疫吸附法[14]。

1.2.4 血清检测结果判定采用Scripps研究所判定方法，Cut-off值(截断值)取正常血清OD读数的均数±3个标准差，读数大于截断值为阳性，否则为阴性[15]。有一项自身抗体表达阳性时，该受试者定义为食管癌高危人群。

1.2.5 胃镜检查常规行食管黏膜碘染色和贲门黏膜美蓝染色，在食管不染区取材，所有活检组织均迅速置于85%乙醇内固定。

1.2.6 病理组织学检查对胃镜获取的活检组织常规处理后切片，每张厚5 μm，HE染色，作组织病理学诊断。

2 结果

2.1 研究流程对来自省部共建食管癌防治国家重点实验室收集的100份早期食管癌患者和100份正常人的血清进行检测；在食管癌高发地区河南省新乡市某地作流行病学调查，有457位无症状居民接受了血清学检测，457例接受了血清学检查的居民中有52例拒绝接受色素胃镜检查，共405例受试者接受了色素胃镜和黏膜病理检查；在食管癌高发区河南省洛阳市作食管癌大规模筛查，共对16 212例35岁以上无症状人群行血清学肿瘤相关抗原自身抗体筛查，共有3 512例受试者发现3种自身抗体有至少1种阳性，在这3 512例血清学检查阳性的受试者中，有416例拒绝接受胃镜检查，共3 096例受试者接受了色素胃镜和黏膜病理检查。

2.2 流行病学调查情况第一组100例正常人中，男性49例，女性51例，年龄35～69(52.47±9.87)岁；100例早期食管癌患者中，男性54例，女性46例，年龄40～78(60.87±7.65)岁。第二组同时接受血清学检查和色素内镜检查者共405例，其性别、年龄分布见表1。第三组共有无症状受试者16 212例，其中男性8 125例，年龄30～87(52,32±10.49)岁；女性8 087例，年龄30～91(53.02±10.49)岁。

表1 第二组受检对象年龄与性别分布 例(%)

2.3 肿瘤相关抗原自身抗体检查结果3种肿瘤相关抗原自身抗体在食管癌组和正常组中的表达差异明显，见表2；3种自身抗体联合检测区分食管癌组和正常组有较高的敏感度和特异性，见表3。

表2 3种自身抗体在早期食管癌患者和健康志愿者血清中表达差异分析

表3 不同自身抗体组合联合检测结果

2.4 血清学和胃镜检查结果对比第二组研究对象中，有405名无症状人群同时接受血清学检查和色素内镜检查，有87例血清学检查抗体阳性。抗体阳性者，色素内镜发现早期癌和不典型增生人数占比大于阴性组，有统计学差异，结果见表4。

表4 自身抗体表达对比食管色素内镜活检病理结果 例(%)

2.5 大规模筛查结果在高发区使用血清学液体活检技术共对16 212例无症状人群进行大规模筛查，受试者有至少一项自身抗体表达阳性时定义为高危人群。检测出3 512例高危人群，其中有3 096例自愿接受色素内镜检查。接受色素内镜检查的受试者中，有1 053例(34.01%)为食管上皮不典型增生，393例(12.69%)为早期食管癌，30例(0.97%)中晚期食管癌，47例(1.52%)其他消化道肿瘤。

3 讨论

食管癌很高的发病率和死亡率严重危害着人民群众的健康，但是经过几十年的研究，食管癌确切的发病机制并不清楚[14]，高发区食管癌的发病率和死亡率仍然居高不下。中晚期食管癌5 a生存率只有10%～20%，而早期食管癌的5 a生存率可高达95%，食管癌的早期发现及早期诊断就尤为重要。目前，色素胃镜检查是高发区无症状人群食管癌筛查最有效的方法[16]，但内镜检查程序复杂、费用昂贵以及对受检者有创伤，同时还需要有经验的内镜医师才能保证检查结果的可靠性，这些原因造成高发区内镜筛查不能大规模推广。目前，急需一种新的食管癌筛查方法改善早期癌筛查现状。

食管癌的发生发展是一个缓慢的多阶段、多因素演进的过程，在肿瘤发展过程中，会产生肿瘤相关抗原，进而刺激机体产生针对这些抗原的自身抗体。自身抗体存在于患者的血液、细胞或组织中，可通过免疫学、分子生物学等方法测定其含量，对肿瘤的早期发现、早期诊断具有一定的价值。通过血清学检查自身抗体，使得早期诊断肿瘤成为一种可能[14]。本研究分别检测了肿瘤相关抗原自身抗体(STK15、P15和MLH1)在食管癌患者和正常人血清中的表达情况，结果表明该组自身抗体在两组中表达差异明显，各个指标在食管癌患者中阳性率均高于正常人。其中，食管癌患者血清P15自身抗体阳性率较正常人升高了14倍(29% VS 2%)，STK15和MLH1均较正常人升高了6倍(STK15∶38% VS 6%；MLH1∶37% VS 6%)。此外，3种自身抗体联合检测可以有效地区分食管癌患者和正常人群，敏感度和特异度分别为78%和 87%。表明该组自身抗体联合检测在食管癌筛查方面具有潜在的应用价值。

在食管癌高发区新乡某地应用本研究发现的自身抗体组合对无症状人群进行血清学和色素内镜筛查。在接受筛查的405例中，血清学自身抗体检查阳性87例(21.48%)，阴性318例(78.52%)；进一步对405例行色素内镜和黏膜活检发现，自身抗体阳性组共检出8例早期癌(9.20%)，29例不典型增生(33.33%)和49例正常上皮(56.32%)；自身抗体阴性组早期癌和不典型增生患者检出率分别为2例(0.63%)和9例(2.83%)。两组之间癌前病变与食管癌占比差异显著，阳性组中检出食管癌占检出总食管癌的80%，表明该组自身抗体联合检测可以将无症状人群中80%的食管癌区分出来，具有较高的筛查价值。本研究6 a间应用自身抗体联合检测技术在食管癌高发区洛阳某地开展了应用性研究，共对16 212例无症状人群进行食管癌筛查，对血清学筛查阳性且自愿接受色素内镜检查的 3 096例行色素内镜和黏膜活检，共检出393例早期食管癌(12.69%)、30例中晚期食管癌(0.97%)和1 053例不典型增生患者(34.01%)。本研究显示自身抗体联合检测液体活检技术结合色素内镜检查食管癌检出率可达2.61%，与单纯应用色素内镜筛查检出率相近。本研究显著减少了胃镜检查人数，降低了筛查成本。

食管癌的发生发展是一个复杂多变的过程，由于肿瘤细胞之间的异质性，如肿瘤之间病理类型的差异、肿瘤细胞基因型及细胞表型之间的差异等导致食管癌癌变过程中会产生不同的肿瘤抗原，从而刺激机体产生不同的自身抗体[14]。本实验室先前的研究报道了大量的在食管癌患者和正常人中表达差异明显的自身抗体，为构建自身抗体食管癌筛查组合提供了分子基础[4]。在不同的研究中分别报道了不同的自身抗体组合用于筛查食管癌癌前病变及早期食管癌患者[5，12，14]，与本研究相比，结果相似，但本研究发现的自身抗体组合应用抗体数目更少，应用更方便。本研究在无症状人群实际应用时，发现有一部分癌前病变患者和食管癌患者抗体表达阴性，提示本自身抗体组合还存在一定的局限性，还需要探索发现新的自身抗体，优化组合，提高检测敏感度。

综上所述，相对于单一指标，STK15、P15和MLH1血清自身抗体联合液体活检检测可以提高无症状人群癌前病变和早期食管癌的检出率，是食管癌高危人群筛查的有效方法。相较于传统色素内镜筛查早期食管癌，这一方法显著减少了内镜检查对象，降低了筛查成本，可以作为食管癌高危人群预警和早期发现的重要手段，具有明显的人群推广应用价值。