自身抗体联合检测在食管癌早期筛查中的意义和应用

王 伟，李爱丽，宋 昕，李欣然，杨苗苗，徐瑞华，魏梦霞，韩文莉，雷玲玲，赵学科，孟超龙，胡守佳，程 锟，王盼盼，钟 侃，胡景峰，郭贵周，王立东

早诊、早防和早治是降低食管癌发病率和死亡率的关键[1]；阐明食管癌变多阶段演进发生的分子机制，建立高危人群分子分型体系和关键检测技术，是实现早期发现的关键[2]；创立简便高效的筛查技术，结合其他危险因素，筛选高危人群范围，进一步通过色素内镜和黏膜病理活检是目前实现无症状高危人群筛查和食管癌早期发现最有效的技术[3]；同时阐明环境—遗传—基因互作对食管癌发生发展的影响[4]，揭示食管癌主要致病危险因素，发现关键分子机制及其与遗传易感性的关系，是实现食管癌个体化早期预防的重要研究策略之一[5]。但是，目前对食管癌早期筛查关键技术指标尚无统一认识，更缺乏大规模高发区无症状人群筛查应用的相关报道。本研究正是在前期发现的食管癌变相关分子机制所建立的分子分型体系的基础上[6-14]，进行无症状高危人群筛查和早期发现的肿瘤相关抗原和自身抗体检测技术研发，并进一步在河南食管癌高发区进行推广应用的初步研究结果。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

①选取2008年安阳市肿瘤医院的350例食管癌患者和350例安阳地区的正常健康人。350例食管癌患者中，男性189例，女性161例，年龄34～78(56.1±3.4)岁；350例正常健康人中，男性173例，女性177例，年龄35～70(53.7±5.3)岁。食管癌患者经组织病理学证实食管鳞癌，均未接受放疗或化疗；350例正常健康人均为正常体检健康个体排除与肿瘤相关疾病、急性感染、过敏、自身免疫性疾病等。②选取来自安阳地区食管癌高发区的1 350例无症状个体进行血清自身抗体联合检测，其中男性594例，女性756例，年龄30～73(52.0±4.2)岁。同时对参与血清学检测的无症状个体进行对应的内镜检查和黏膜病理活检。③自2010年10月至2019年12月对林州高发地区现场研究基地，共计20 153例无症状个体进行血清自身抗体活检筛查，其中男性9 976例，女性10 177例，年龄35～70(53.0±5.6)岁。对血清学检测4种自身抗体中至少1种抗体阳性者进行内镜检查和黏膜活检。

1.2 实验方法

1.2.1 血样采集与保存所有纳入研究的22 203例研究对象，每例抽取空腹静脉血5mL至离心管中，室温中静置30 min，离心(2 000 r·min-1)，吸取上层血清分装，每管分装100 μL，-80 ℃冰箱储存。

1.2.2 血清自身抗体检测4种肿瘤相关抗原蛋白(cyclinB1、TGF-β1、Bcl-2、BRCA2)购于武汉艾美捷科技有限公司。将待检测的血清样本用样品稀释液按1∶500的比例进行稀释，然后将稀释后的血清样本加入已包被抗原的48孔酶标板的反应孔中，加样每孔100 μL，置于37 ℃恒温培养箱孵育1 h，洗涤液洗涤3次，每次洗涤3 min。已知阳性的血清为阳性对照,包被缓冲液为阴性对照。将辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白用第二抗体稀释液按1∶40 000的比例进行稀释，加样每孔100 μL，置于37 ℃恒温培养箱孵育50 min，洗涤液洗涤3次，每次3 min。加入TMB-过氧化氢尿素显色液，每孔100 μL，置于37 ℃避光反应15 min，然后向每个反应孔中再加入50 μL终止液终止反应，于20 min内用酶标仪读取OD450光密度值，并用空白对照调零。

1.2.3 血清自身抗体检测结果判定以阴性对照孔所测OD值的平均数加两个标准差(Mean+2SD)为截断值(cut-off值)，反应孔中OD值读数大于等于截断值的判断为阳性，反应孔中OD值读数小于截断值的判断为阴性。

1.2.4 食管内镜检查和黏膜活检常规在食管中1/3段(距门齿30～32 cm)、下1/3段(食管、贲门交界线上2～3 cm)和贲门(齿状线下2 cm) 各取1～2块活检组织，并在肉眼可见的病变处随机取材，必要时进行食管黏膜碘染色和贲门黏膜美蓝染色。在食管不染区和贲门染区取材，所有活检组织均迅速置于95%乙醇内固定。常规脱水后石蜡包埋切片，每张切片厚5 μm，做常规HE染色，核实组织病理学诊断。

1.2.5 病理组织学检查根据细胞形态和组织结构,将食管上皮分为正常(normal,NOR)、基底细胞过度增生( basal cell hyperplasia,BCH)、不典型增生(dysplasia,DYS) 、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和其他肿瘤(other,OTH)。

1.3 统计学方法配对资料比较和自身抗体检查结果分析采用χ2检验。所有计算均使用SPSS 23.0进行，P<0.05被认为有效。

2 结果

2.1 肿瘤相关自身抗体在食管癌患者中检出的敏感性和特异性350例食管癌和350例正常人的血液自身抗体检测分析结果显示，cyclinB1、TGF-β1、Bcl-2、BRCA2这4种自身抗体在食管癌患者血清中阳性表达水平明显高于正常人群。其中食管癌患者中TGF-β1 (46.00%)和Bcl-2 (52.00%)阳性表达率最高，相对于正常人分别升高了3倍(cyclinB1∶38.57% VS 12.57%)，2.3倍(Bcl-2：52% VS 22%)和2.5倍(TGF-β1∶46.00% VS 18.00%；BRCA2∶41.43% VS 16.57%)。提示4种自身抗体在食管癌患者和正常人血清中存在差异(表1)。同时，对4种不同肿瘤相关抗原进行了优化组合，发现当4种肿瘤相关抗原联合检测时，食管癌患者阳性率是正常人的4倍，同时对食管癌诊断的灵敏度高达82.00%，特异性达到79.71%。结果表明，同时运用4种指标联合检测，对两组人群具有较高的正确判定性和诊断价值，检测效能达到最佳(表2)。

表1 4种血清自身抗体在食管鳞癌患者和正常人群中的表达 例(%)

表2 4种肿瘤相关抗原组合灵敏度和特异性

2.2 无症状人群血清自身抗体检测联合内镜检查、黏膜病理活检验证结果对安阳食管癌高发区1 350例无症状人群进行4种血清自身抗体联合检测，性别、年龄分布见表3。有261例至少对一种指标显示抗体阳性,阳性率19.33% (261/1 350)。进一步对226例自身抗体阳性高危人群进行内镜下检查(35例自身抗体阳性者未能按时进行胃镜检查)，其中发现NOR(49例，21.68%)、BCH(52例，23.01%)、DYS(85例，37.61%)、SCC(36例，15.93%)和OTH(4例，1.77%)；随食管癌前病变程度的加重，至少一种抗体阳性检出率呈逐渐递增趋势,而且出现多种自身抗体阳性，226例自身抗体阳性率对应内镜检查结果见表4。自身抗体阴性者中有1 043例自愿接受胃镜检查，其中发现NOR(913例，87.54%)、BCH (79例，7.57%)、DYS (48例，4.60%)、SCC(1例)和OTH (2例，0.19%)，见表5。对226例进行内镜检查的，通过黏膜病理活检，共发现了85例食管癌前病变，早期食管癌为33例。发现随着食管疾病的加重，血清自身抗体指标阳性检出率也逐渐升高。而在对自身抗体阴性组进行内镜下黏膜病理活检中，检出食管癌1例，其他上消化道肿瘤2例。

表3 1 350例无症状人群性别、年龄分布 例(%)

表4 226例自身抗体阳性者的色素内镜下各级病变情况 例(%)

表5 血清自身抗体表达对应内镜活检病理结果 例(%)

2.3 大规模人群应用自2010年至2019年，本研究团队利用血清学自身抗体联合检测技术在河南林州地区进行了大规模人群推广应用。共筛查20 153例35～70岁无症状人群，确定了自身抗体阳性高危个体3 855例(19.13%，3 855/20 153)例。对这些高危人群进行色素内镜和食管黏膜病理学检查，共发现食管上皮不典型增生(癌前病变)1 350例(35.02%，1 350/3 855)，上消化道肿瘤患者605例，包括544例食管癌和61例其他上消化道肿瘤；544例食管癌患者中，早期(T1N0M0)患者占95.04%(517/544)，见表6。同时对黏膜活检不典型增生的1 350例无症状高危人群进行长达10 a的随访调查，共发现234例癌前病变发展为早期食管癌，癌变率达17.33%(234/1 350)。

表6 3 855例高危人群对应色素内镜检查各级病变结果 例(%)

3 讨论

前期的研究发现，食管癌的发病是环境—遗传—基因交互作用共同导致的结果[2]。肿瘤患者在表达肿瘤相关抗原时，血清中会产生多种抗肿瘤相关抗原的自身抗体，可能作为肿瘤发生过程中识别异常或细胞机制失调的早期标志[15]。但目前尚未发现可以完全识别或区分肿瘤患者和正常人群任何单一血液指标。因此，联合多个肿瘤标志物可能是肿瘤早期发现和诊断的潜在方法。

通过对第一组食管癌患者血清和正常人群血清中自身抗体的对比研究发现，cyclinB1、TGF-β1、Bcl-2、BRCA2这4种自身抗体在食管癌患者血清中的表达明显高于正常人群。在对不同指标组合进行优化时，发现当同时对4种自身抗体联合检测时，对食管癌诊断的灵敏度和特异性达到最好，可以更好地区分癌症患者和正常人群。同时为了验证指标组合的准确性，在第二组1 350例无症状人群进行了应用验证，对所有参与血清学检测的人群进行了内镜检查，结果发现，自身抗体阳性人群中检出食管癌前病变和食管癌的远远高于自身抗体阴性人群。对20 153例无症状人群中的阳性个体进行内镜活检，检出食管癌和癌前病变的概率与第二组人群接近，进一步证明了这4种自身抗体联合检测时的效能。

目前在临床上，内镜检查仍是早期食管癌前检出的重要手段。本团队总结了十余年食管癌高发区无症状人群筛查的经验，发现在无症状高危人群筛查中，内镜检查存在一定的局限性。接近80%的无症状人群在接受胃镜检查时属于正常状态，仅有20%的人群可以检出病变。并且限于食管内镜的检测效率低下、成本昂贵和缺乏经验丰富的内镜医师，导致无法在大规模筛查中展开。因此加强对食管癌和癌前病变患者血清关键相关蛋白的甄别和鉴定，建立高危人群筛查的指标和方法十分重要[16]。本研究利用血清学检测多种肿瘤相关自身抗体，在大规模人群应用中较好地判定高危人群，缩小了内镜检查范围，在不降低检出准确率的前提下，大大减少了盲目检查的人数，提高了早期癌的检出率，节约了检查成本，值得在更大规模人群中推广应用。