水鹿、毛冠鹿感染芽囊原虫的首次报道

何廷美，陈善瑜，施小刚，柴宜均，樊佳琦，罗静怡，程跃鸿，彭广能*

（1.四川卧龙国家级自然保护区管理局 四川阿坝 623006；2.四川农业大学动物医学院 成都 611130）

芽囊原虫（Blastocystis）是一种可寄生于人类和多种动物的厌氧性、单细胞肠道原虫，在全球广泛分布，主要经过粪口以及接触传播[1]。先前的报道表明，该寄生虫与腹泻、腹痛和呕吐等非特异性胃肠道症状相关，并疑似与肠易激综合征（IBS）和荨麻疹有关[2]。根据小亚基核糖体RNA（Small-subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）基因序列差异，芽囊原虫目前可分为17 种亚型（ST1～ST17），其中ST1～ST9、ST12 亚型为人兽共患亚型，ST10～ST17 亚型仅感染动物[3]。芽囊原虫已在人和多种动物中被报道，其中鹿科动物被报道的有梅花鹿、马鹿、驯鹿[2,4,5]。2020 年4 月至5 月在对四川卧龙自然保护区野外野生动物肠道寄生虫进行调查的过程中发现采集的水鹿（n=9）、毛冠鹿（n=4）粪便样品检出芽囊原虫并鉴定出所感染的亚型分别为ST14（n=2）、ST5（n=1)、ST13（n=1）。据查未见有关于水鹿、毛冠鹿感染芽囊原虫的报道。该调查扩大了芽囊原虫的宿主范围且提示水鹿是传播人兽共患芽囊原虫的潜在宿主，具有一定的公共卫生学意义。

1 基本情况

2020 年4 月-5 月对卧龙自然保护区野外野生动物肠道寄生虫调查时采集到的9 份水鹿（Rusa unicolor）粪便和4 份毛冠鹿（Elaphodus cephalophus）粪便。随后针对该粪便样品基于SSU rRNA 序列的PCR 扩增方法检测芽囊原虫。

2 方法

2.1 粪便基因组DNA 的提取

每份粪便取200～300mg 置于2mL 离心管中，加入蒸馏水，混匀，12,000r/min 离心1min，弃上清，重复上述步骤直至清洗干净表面的重铬酸钾得到清亮透明的液体。随后按照E.Z.N.A.®Stool DNA Kit粪便全基因组提取试剂盒（OMEGA Biotek Inc D4015-01，USA）说明书的操作步骤提取DNA，操作完成后将DNA 放于 -20℃冰箱中待用。

2.2 PCR 扩增及测序

用 PCR 技术基于芽囊原虫 SSU rRNA 基因位点对所提取的DNA 样品进行扩增，将试剂和样品 DNA 混匀后的 PCR 管置于PCR 仪中反应。根据文献[6]中给出的引物和 NCBI 中的基因序列来设置引物和反应条件与反应体系。

1）引物：所需合成引物序列及产物DNA 片段大小见表1。

表1 芽囊原虫PCR引物

2）反应体系：PCR 扩增体系为25μL，见表2。

表2 反应体系

PCR 扩增反应条件：94℃预变性5min；93℃变性1min；59℃退火1min；72℃延伸1min；循环30 次；72℃再延伸3min；10℃永久保存。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后由上海生工生物技术有限公司进行单向测序。

2.3 SSU rRNA 序列分析

测序后的序列在NCBI 的Blast 上进行相似性比对，将所获得的序列与GenBank 比对出来同源性最高序列进行比较，确定序列是否是芽囊原虫的基因组，分析序列差异确定亚型。

3 结果

3.1 粪便中芽囊原虫SSU rRNA 基因的PCR 扩增结果

9 份水鹿（Rusa unicolor）粪便和4 份毛冠鹿（Elaphodus cephalophus）粪便样品中，扩增出4 份约为600bp 的阳性样品，经公司测序结果显示，成功扩增出的4 份样品均是芽囊原虫阳性样品，阳性样品分别来源于3 份水鹿、1 份毛冠鹿，表明这些水鹿、毛冠鹿都感染了芽囊原虫。

3.2 芽囊原虫SSU rRNA 的序列分析及亚型分布

测序成功的序列在Blast 上进行相似性比对，结果显示有4 个芽囊原虫阳性样品，被分别归为3 类不同的序列，上传至NCBI 数据库，获得登录号为 MT889739、MT889740、MT764942、MT889741。其中毛冠鹿源芽囊原虫属于ST13 亚型（MT889741）；另3 份水鹿芽囊原虫样品中，1 份属于ST5 亚型（MT889740），2 份为ST14（MT889739、MT764942）。

4 讨论

芽囊原虫是人类和各种动物中最常见的寄生虫之一[7]。一些研究发现，无论是在发展中国家还是发达国家，芽囊原虫感染都与胃肠道和营养紊乱有关[7]。除人类外，该寄生虫还经常在动物宿主中发现，包括非人灵长类，以及其他哺乳动物，如偶蹄目、犬齿目、啮齿类动物、有袋类动物以及鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、环节动物和昆虫[8,9]。但在偶蹄目鹿科动物中目前已有梅花鹿、马鹿和驯鹿感染芽囊原虫的报道[2,4,5]，没有水鹿、毛冠鹿感染芽囊原虫的相关报道。本文是关于芽囊原虫感染水鹿、毛冠鹿的首次报道。

芽囊原虫目前可分为17 种亚型（ST1～ST17），其中ST1～ST9、ST12 亚型属于人兽共患亚型，ST10～ST17 亚型仅感染动物[3]。从偶蹄目中分离出的芽囊原虫有11 个亚型，包括7 个已知亚型（ST1、ST3、ST4、ST5、ST10、ST13、ST14）和4 个新亚型（Novel1、Novel2、Novel3、Novel4）。其中ST5 亚型最为普遍[9]。本文中所鉴定的亚型有ST14（n=2）、ST13（n=1）、ST5（n=1），其中ST14、ST13 为动物特有的亚型仅感染动物。ST5 为人畜共患亚型，该亚型在江西省的农村地区小孩和猪身上被发现，该地区很多家庭饲养小猪，猪和孩子有时会共用室外区域[10]。这些报告表明ST5 具有人畜共患的潜力，水鹿可能是芽囊原虫的潜在传染源。

研究结果显示，水鹿、毛冠鹿也是芽囊原虫的宿主之一，且发现了水鹿源的人畜共患亚型，表明水鹿是芽囊原虫人畜共患病的潜在传染源。本文对水鹿、毛冠鹿感染芽囊原虫的首次报道使我们对芽囊原虫宿主有了更加全面的认识。