阿勒泰羊Fsp27基因5'UTR区g.16767667位点G>A突变与其尾脂沉积能力关联性分析

张 伟，王世银，高 莉，徐梦思，王新华*，甘尚权(. 新疆农垦科学院 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆 石河子 83000；. 新疆农业职业技术学院，新疆 昌吉 8300)

脂肪特异性27 kDa蛋白(Fat specific protein 27, Fsp27)最早在鼠脂肪细胞系TA1中筛选特殊基因表达时被发现[1]，在脂肪组织中高表达，在促进脂肪细胞中脂滴融合和抑制脂肪分解过程中发挥重要作用[2-4]。鼠敲除Fsp27基因后脂肪水解速率显著升高，脂肪细胞中的大脂滴转变成为很多分散均匀的小脂滴[5]。本课题组前期对不同尾脂沉积能力绵羊品种Fsp27基因序列突变情况进行了系统研究，在该基因5'UTR区、CDS区和3'UTR区发现了大量的SNP位点。初步分析结果表明，部分位点在不同尾脂沉积能力绵羊品种群体中的分布具有明显的差异性。前期研究结果表明，在上述SNP位点中5'UTR区g.16767667位点G>A突变在不同尾脂沉积能力绵羊品种群体中的分布差异显著，可能与绵羊的尾脂沉积能力具有相关性。本文将以尾脂沉积能力极强的阿勒泰羊为研究对象，对Fsp27基因5'UTR区g.16767667位点G>A突变与阿勒泰羊尾脂沉积能力关联性进行深入分析，以期为进一步阐明Fsp27基因在阿勒泰羊优良尾脂性状形成中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集及脂尾体积测量

本试验所用250份阿勒泰羊耳组织采自新疆阿勒泰地区富蕴县阿勒泰羊种群核心群1.5～2岁个体，每份样品进行编号，同时测量该样品对应个体脂尾的长、宽和厚，并记录该阿勒泰羊的性别，以备后期分析。采集的耳组织4 ℃暂时冷藏保存，并尽快运回实验室置于-20 ℃冰箱中保存备用，用于提取阿勒泰羊基因组。

1.2 DNA提取

耳组织样品基因组DNA采用动物组织基因组DNA提取试剂盒(索莱宝，中国)提取，琼脂糖凝胶电泳检测合格后置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 引物设计

检索Ensemble网站(http://asia.ensembl.org/index.html)，获得绵羊Fsp27基因序列，然后与UCSC中(http://genome.ucsc.edu/)收录的绵羊基因组序列(Oar_v4.0, Nov. 2015)比对，截取包含Fsp27基因5'UTR区的序列共计780 bp设计引物，上游引物序列：TGCCGACGTAAGATGGACTCTG，下游序列：TCTGCGATGGAGATTGGGGATC，Tm值58 ℃，扩增片段大小365 bp，g.16767667位点位于扩增片段靠近中部位置，以利于后续进行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)检测。引物使用Oligo 6.0软件设计，并由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.4 PCR扩增及SSCP检测

以阿勒泰羊基因组为模板，采用上述引物扩增阿勒泰羊Fsp27基因5'UTR区，反应采用20 μL体系 Premix Taq (TAKARA Taq Version 2.0 plus dye)10 μL，上下游引物各0.5 μL (10 μM)，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测合格后置于4 ℃冰箱保存备用。分别取2 μLPCR产物与8 μL变性上样缓冲液混合，置于100 ℃金属浴上变性10 min，迅速置于冰上降温冷却，然后全部上样于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶，先300 V电压下电泳5 min，然后在120 V下电泳12 h。电泳结束后将凝胶取下，进行银染，然后置于凝胶成像仪(BIO-RAD)中拍照。

1.5 Fsp27基因突变情况检测与其绵羊尾脂沉积能力关联性

选择SSCP带型不同的PCR产物送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，以确定不同基因型与SSCP带型的对应关系，然后以此对250份阿勒泰羊基因组进行分型。将分型结果与前期测量的对应个体尾型数据进行对应分析，以找出不同基因型与阿勒泰羊脂尾体积数据的对应关系，进而对相应基因型阿勒泰羊的尾脂沉积能力做出评估。

1.6 数据分析

采用SPSS13.0软件计算Fsp27基因g.16767667位点SNP的基因型频率及等位基因频率，并使用卡方检验的方法分析群体中基因型是否处于Hardy-Weinberg平衡。阿勒泰羊尾形数据用平均数±标准差表示，并进行单因素方差分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著，多重比较采用最小显著差数法(least significant difference, LSD)。

2 结果与分析

2.1 基因组提取及PCR扩增结果

采用琼脂糖凝胶电泳对提取的基因组DNA和PCR产物进行检测(图1)，从电泳图片可见提取的阿勒泰羊基因组DNA电泳条带亮度较高，没有明显拖带(图1A)，说明提取的DNA浓度和质量均较高，可以满足后期PCR扩增的要求。PCR扩增产物电泳结果条带清晰明亮，没有杂带，条带大小符合预期设计(图1B)，说明引物的特异性和扩增效率均很高，为后期进行高质量SSCP检测提供了保障。

图1 阿勒泰羊部分基因组DNA(A)和Fsp27基因5'UTR 区PCR产物检测(B)Fig.1 Detection of Altay sheep DNA (A) and PCR production of Fsp27 gene 5'UTR region (B)

2.2 SPSS分型及基因测序验证

PCR产物经SSCP检测可见三种不同的带型(图2A)，挑选不同带型对应的PCR产物进行基因测序，可知三种带型分别对应GG、AG和AA三种基因型(图2B)。所以，Fsp27基因5'UTR区g.16767667位点G>A突变在阿勒泰羊群体中三种基因型均可以检测到。

图2 SSCP检测结果(A)及相应PCR产物测序结果Fig.2 Result of SSCP detection (A) and sequencing data of corresponding PCR production (B)

2.3 不同基因型在阿勒泰羊群体中分布及与尾型数据的对应性分析

通过250份阿勒泰羊基因组DNA的检测结果表明，Fsp27基因5'UTR区g.16767667位点G>A突变产生的三种基因型GG、AG和AA在阿勒泰羊群体中的分布存在明显的差异。GG基因型个体占样本总量的47.2%，AG基因型占38.4%，而AA基因型仅占14.4%，在检测的阿勒泰羊群体中G等位基因频率达66.4%，为优势等位基因。卡方检验结果表明，该位点在阿勒泰羊群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)，说明该位点在阿勒泰羊品种群体中处于遗传平衡状态，同时也可推测在阿勒泰羊的培育过程中该位点可能没有受到选择、迁移和遗传漂变等的影响。

表1 g.16767667位点G>A突变基因频率和基因型频率在阿勒泰羊群体中的分布以及Hardy-Weinberg平衡的卡方检验Table 1 Genotypes and allele frequencies distributions of g. 16767667 locus G>A SNP in Altay sheep population and Chi-square test for Hardy-Weinberg equilibrium

为了进一步分析g.16767667位点G>A突变不同基因型对阿勒泰羊尾脂沉积能力的影响，将不同基因型阿勒泰羊个体的尾形数据进行了对比分析(表2)。结果表明，不论是公羊还是母羊，GG和AG基因型个体脂尾(臀)的长、宽和厚3项数据均显著高于AA基因型个体(P<0.05)，GG基因型个体亦略高于AG基因型个体，但差异不显著(P>0.05)。

表2 阿勒泰羊不同基因型个体尾形数据对比分析Table 2 Data comparison of fat tail size of Altay sheep with different genotype

3 讨 论

有关绵羊SNP位点与脂肪沉积能力的关联性已有相关文献报道，本课题组前期在绵羊7号染色体和X染色体上发现了多个与绵羊尾脂沉积能力相关的SNP位点[6-9]，2012年伊朗学者Moradi等使用高密度SNP芯片对产于伊朗的脂尾和瘦尾绵羊品种进行全基因组精细扫描，亦检测到大量与绵羊尾脂沉积能力相关的SNP位点[10]。本研究证实阿勒泰羊Fsp27基因5'UTR区g.16767667位点G>A突变产生的三种基因型GG、AG和AA在阿勒泰羊群体中的分布存在明显的差异，且与阿勒泰羊的尾形存在关联性，GG和AG基因型的个体，脂尾(臀)的长、宽和厚三项数据均显著高于AA基因型的个体(P<0.05)。这些SNP位点均与绵羊的尾脂沉积能力高度相关，所以可以作为很好的分子标记应用于低脂肪绵羊品种的选育。但是，这些SNP位点是否直接参与脂肪沉积，以及参与的途径仍需后续开展深入的研究。

Fsp27基因在动物体脂肪代谢过程中所发挥的重要作用，已得到相关文献的证实。Fsp27定位在脂肪细胞脂滴和的内质网表面[11-12]，通过促进小脂滴相互融合为大脂滴[3,13]，以及特异性抑制激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase, HSL)在脂滴表面的定位，进而抑制其对脂肪的水解作用[4]，最终达到促进脂肪沉积，抑制脂肪分解的作用。Fsp27的半衰期很短，所以，机体通过调控Fsp27的表达水平可以快速响应体内脂肪酸的水平，进而保障了机体内脂肪的沉积和分解活动与机体的能量供应相适应[11]。本研究涉及的g.16767667位点G>A突变处于Fsp27基因5'UTR区，由于mRNA的5'UTR区与翻译起始调控、稳定性、剪切加工及细胞内的运输和定位等过程密切相关[21]，所以5'UTR区的基因突变很可能会影响上述生物学过程的正常进行，进而可能影响Fsp27基因mRNA的翻译及其蛋白水平，并最终影响其生物学功能。本研究中GG和AG基因型个体尾形数据均显著高于AA基因型的个体(P<0.05)，有可能与GG和AG基因型有利于Fsp27基因mRNA的翻译，提高其蛋白水平，进而促进脂肪细胞中脂肪的沉积有关，但其具体作用机制尚有待进一步的研究。

阿勒泰羊的形成具有特定的人文和生态环境背景。阿勒泰羊主要生活在我国新疆北部的阿勒泰地区，当地生态环境的一个显著特点是夏秋季节气候凉爽、牧草丰茂，但是冬季枯草期漫长而寒冷。所以，生活在这里的野生草食动物或者纯放牧状态的草食家畜必须具备在短期内迅速在体内蓄积足够脂肪的能力，否则无法顺利越冬。另外，阿勒泰地区主要生活的是哈萨克族牧民，常年以放牧为生，在寒冷的冬季亦需要摄入大量的肉和脂肪来满足机体的能量供应，抵御当地的寒冷天气，所以历代牧民加强了储脂能力强的绵羊品种的选育。在这种自然和人为的双重选育下才培育出了具有优良脂尾(臀)的阿勒泰羊。但是，近年来随着人们生活水平的提高，人们对高脂肪肉食品摄入引起的心脑血管疾病发病率升高日益关注，市场对低脂肪羊肉的需求量日益增大[15]。另外，随着草场保护政策的推进，以及舍饲养羊的逐渐普及和圈舍、饲草条件的改善，阿勒泰羊尾部脂肪的保命作用已没有太多实际的价值。所以，该品种存在进一步选育提高，在保留其优良性状的前提下逐步提高其胴体的瘦肉率的迫切需要。因而需要阐明其尾部脂肪沉积相关的分子调控机制，用于指导育种实践，提高育种效率。就此而言，围绕阿勒泰羊尾脂沉积开展相关功能基因研究又具有很大的现实意义。

4 结 论

本研究对Fsp27基因5'UTR区g.16767667位点G>A突变在阿勒泰羊群体中的分布以及与阿勒泰羊尾脂沉积能力进行了初步研究，发现GG和AG基因型在群体中的比重较大，且其尾形数据也显著高于AA基因型个体，推测G等位基因有利于阿勒泰羊尾脂沉积。上述结果将为进一步阐明阿勒泰羊优良脂尾(臀)性状的形成机制以及低脂肪绵羊品种的培育提供基础数据。