分子印迹电化学发光传感器检测毒死蜱

张田欣 刘意明 杨敏丽

摘  要： 石墨相氮化碳纳米薄片（g-C3N4NSs）具有优良的电化学发光（ECL）性能和良好的成膜特性.以g-C3N4NSs作为ECL材料，利用其良好的成膜性能将其固定在玻碳电极（GCE）上，再以毒死蜱（CPF）作模板分子，甲基丙烯酸（MAA）作功能单体，通过分子自组装制备分子印迹聚合物（MIP）.将该聚合物引入g-C3N4NSs修饰电极，构建了一个MIP-ECL传感器.除去模板分子的传感器能够选择性识别CPF，利用CPF对g-C3N4NSs ECL信号的淬灭作用实现了CPF的高灵敏、高选择性检测.传感器对CPF的线性响应范围是1.0×10-8～1.0×10-4 mol·L-1，检出限（LOD）是5.0 nmol·L-1，用于蔬菜中CPF残留量检测，结果令人满意.

关键词： 电化学发光（ECL）; 氮化碳纳米薄片（g-C3N4NSs）; 分子印迹聚合物（MIP）; 毒死蜱（CPF）

中图分类号： O 657.1    文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2021）06-0697-09

Abstract： Graphite carbon nitride nanosheets （g-C3N4NSs） exhibite excellent electrochemiluminescence （ECL） performance and good film-forming properties. In this paper， g-C3N4NSs were used as an ECL material to be fixed on a glassy carbon electrode（GCE）. A molecularly imprinted polymer （MIP） was prepared by molecular self-assembly with chlorpyrifos （CPF） as template molecule and methacrylic acid （MAA） as functional monomer. The polymer was then introduced into g-C3N4NSs modified electrode to construct a MIP-ECL sensor. After removing the template molecule， the sensor can specifically recognize CPF. Based on the specific recognition and quenching effect of CPF on the ECL signal of g-C3N4NSs， the high sensitive and selective detection of CPF was achieved. The sensor shows a linear response to CPF in range of 1.0×10-8-1.0×10-4 mol·L-1 and limit of detection （LOD） of 5.0 nmol·L-1. It was used to detect CPF residues in vegetables and the results were satisfactory.

Key words： electrochemiluminescence（ECL）; carbon nitride nanosheets and the results were satisfactory（g-C3N4NSs）; molecular imprinting polymer（MIP）; chlorpyrifos（CPF）

0  引 言

毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）是一種有机磷农药，分子式为C9H11ClNO3PS. CPF作为一种低毒性农药，被广泛用作农作物的杀虫剂.CPF水溶性低、土壤吸附系数高，容易长时间残留在自然环境中，造成城市水体污染和水生生物中毒[1-2].CPF还会通过胃肠道、皮肤、呼吸道等被人体吸收，引起神经缺陷、发育和自身免疫性疾病等[3]，因此准确、方便地检测农作物和环境产品中的CPF残留量，对人类健康和生态保护至关重要.

目前检测CPF的方法包括气相色谱法[4]、液相色谱-质谱联用法[5]、化学发光法[6]、酶/抗体免疫分析法[7-8]、表面增强拉曼光谱法[9]、电化学发光（ECL）法[10]等.前几种方法拥有优异的灵敏度与准确性，但也有很大的局限性，如仪器大且笨重、操作繁琐复杂、价格昂贵、不适合现场实时检测等.而ECL检测灵敏度高、仪器设备简单、背景信号低、检测快速和方便，受到越来越广泛的关注.

分子印迹技术（MIT）是针对目标分子构筑有效的印迹空腔，从而合成对目标分子具有特异性识别的分子印迹聚合物（MIP）[11]的技术.MIP因具有良好的机械/化学稳定性、高特异性、低成本，以及易于制备等特点，作为传感器的识别单元，被广泛应用于光学传感器[12-13].

氮化碳纳米薄片（g-C3N4NSs）是近几年新发展的一种ECL材料，它不仅具有优良的ECL性能，而且毒性低、生物兼容性好，还具有良好的分散性和成膜特性. 迄今为止，还没有将MIP与ECL相结合用于CPF检测的报道.本工作以g-C3N4NSs作为ECL材料，结合MIP技术，构建了用于检测CPF的MIP-ECL传感器，实现了对CPF的高灵敏、高选择性检测.

1  实验部分

1.1 实验试剂

三聚氰胺（C3H6N6）、过硫酸钾（K2S2O8）、乙酸（CH3COOH）、盐酸（HCl）无水乙醇均购于Sigma-Aldrich公司;氢氧化钠（NaOH）、氯化钾（KCl）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、磷酸氢二钾（K2HPO4）均购于国药集团上海化学试剂有限公司;甲基丙烯酸（MAA）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）、毒死蜱（CPF）、偶氮二异丁腈（AIBN）均购于上海Adamas试剂公司;辛硫磷、马拉硫磷、伏杀磷、阿维菌素、甲基对硫磷均购于Dr.Ehrenstorfer GmbH公司.所有药品均为分析纯，溶液以超纯水配置.

1.2 实验仪器

透射电子显微镜（TEM），日本电子公司，JEOL 2100;场发射扫描电子显微镜（FE-SEM），日本日立公司，Hitachi S-4800;X射线光电子能谱（XPS），美国PE公司，ULVCA-PHI;紫外分光光度仪，日本岛津公司，UV-1800;荧光分光光度仪，日本岛津公司，RF-5301PC;恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂，GZX-DH-X;离心机，上海安亭科学仪器厂，TGL-16C;数控超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司，KQ-100DE;恒温磁力搅拌器，上海梅颖浦仪器制造有限公司，95-I;pH计，上海洛奇特电子设备有限公司，PHS-25;马弗炉，上海慧泰仪器制造有限公司，PRD-C3000;电化学工作站，上海辰华仪器有限公司，CHI 660E;ECL分析系统，西安瑞迈分子仪器责任有限公司，MPI-A/B.

三电极系统：工作电极为玻碳电极（GCE），铂（Pt）丝为对电极，银/氯化银（Ag/AgCl）电极（饱和KCl溶液）为参比电极.

1.3 g-C3N4NSs的合成

g-C3N4NSs的合成参照文献[14]的方法，先合成体相g-C3N4，再经过酸化剥离而得到g-C3N4NSs.具体方法为：1） 称7.5 g C3H6N6固体放入坩埚，马弗炉600 ℃灼烧3 h，取出后自然降温，得到淡黄色g-C3N4固体，研磨，备用;2） 取2.0 g合成好的g-C3N4固体粉末，加入100 mL浓HCl，搅拌6 h，用蒸馏水抽滤洗涤至pH=7.0，收集产物，烘箱60 ℃干燥4 h;3） 取50 mg产物，加50 mL超纯水，超声2 h，5 000 r·min-1离心6 min，去除未剥离的块状g-C3N4，取上层白色溶液，烘干即得g-C3N4NSs，使用时配置质量浓度为1.0 mg·mL-1的溶液.

1.4 MIP-ECL传感器的构建

1.4.1 MIP制备

首先，量取5 mL甲醇于烧杯中，然后加入0.1 mmol的模板分子CPF和0.4 mmol的功能单体MAA，超声5 min使其混匀，形成预聚合复合物.继续加入0.4 mmol交联剂EGDMA和0.016 g引发剂AIBN，自聚合反应30 min，得到MIP.同样条件下，除了不加入CPF，其他操作步骤相同，获得非分子印迹聚合物（NIP）.

1.4.2 传感器构建

传感器的构建如图1所示.首先以0.5 μm的三氧化二鋁（Al2O3）打磨GCE至光滑，用蒸馏水和乙醇依次冲洗，再用超声处理3 min，晾干.取6.0 μL g-C3N4NSs分散液滴涂在GCE上，晾干，即得g-C3N4NSs/GCE.再移取4 μL上述制备好的MIP聚合液滴涂在g-C3N4NSs/GCE上，得到MIP/g-C3N4NSs/GCE.把电极置于甲醇与乙酸体积比为9∶1的洗脱液里，静置13 min，除去模板分子CPF，得到能特异识别CPF的分子印迹ECL传感器，记为MIP-ECL传感器.

1.5 ECL检测

采用三电极系统，以修饰电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，Pt丝电极为对电极，将该电极系统插入0.1 mol·L-1 PBS（pH=7.4，含0.1 mol·L-1 K2S2O8）溶液中，在0～-1.0 V的电压范围内以100 mV·s-1扫描速率，记录ECL信号（光电倍增管电压-600 V）.检测CPF时，将上述制备的MIP-ECL传感器插入不同浓度的CPF甲醇溶液，孵育14 min后取出，用蒸馏水冲洗干净，插入检测底液，根据孵育前后ECL信号的变化值（∆I）对CPF进行定量检测.

2  结果与讨论

2.1 g-C3N4NSs的形貌表征

图2（a）是剥离前体相氮化碳（C3N4）的FE-SEM图，图2（b）是剥离后g-C3N4NSs的TEM图.可以看出，C3N4有很多层，并且呈大块状堆积，而g-C3N4NSs呈片状，说明体相C3N4经过酸化处理后被成功剥离.

2.2 g-C3N4NSs的XPS表征

图3是g-C3N4NSs的XPS图谱.图3（a）是g-C3N4NSs全谱图，显示了C，N，O元素的存在;图3（b）是g-C3N4NSs中C 1 s的高分辨率谱图，284.6，286.2和288.0 eV分别对应3种C的结合能;图3（c）是g-C3N4NSs中N 1 s的高分辨率谱图，4个峰398.5，399.8，401.0和404.1 eV分别对应4种N的结合能[15].通过以上参数，可以判断g-C3N4NSs制备成功.

2.3 MIP-ECL传感器的表征

测试了传感器构建过程中相应电极的电化学阻抗（EIS），循环伏安（CV）和ECL信号、结果如图4所示.

图4（a）是不同修饰电极在5 mmol·L-1 [Fe（CN）6]3-/4-（含0.1 mol·L-1 KCl）溶液中的EIS响应曲线.可以看出，g-C3N4NSs/GCE（红线2）的电阻值（Rct）明显大于裸电极（黑线1），这是因为g-C3N4NSs是半导体，会妨碍[Fe（CN）6]3-/4-与电极表面电子转移，导致Rct增加，证明了g-C3N4NSs成功地修饰到电极表面.当MIP模修饰到g-C3N4NSs/GCE时（蓝线3），Rct急剧增加，因MIP膜不导电，会妨碍电子传递，导致Rct增大，说明MIP模成功引入.当模板分子CPF被洗掉，电子传递通道打开，电子传递速率明显变快，Rct变小（绿线4）.重新孵育CPF后，Rct再次变大（粉线5），这是由于电子传递通道再次被阻塞.

图4（b）是不同修饰电极在5 mmol·L-1 [Fe（CN）6]3-/4-（含0.1 mol·L-1 KCl）溶液中的CV响应曲线.该结果与EIS响应一致.

图4（c）是不同修饰电极的ECL信号.g-C3N4NSs/GCE表现出很强的ECL信号，表明g-C3N4NSs被成功修饰到电极上.引入MIP后，ECL信号明显降低;洗脱除去CPF后，ECL信号回升，重新孵育CPF后，空腔被堵住，ECL信号再次下降.

以上实验结果均可证明MIP-ECL传感器的成功构建.

2.4 实验条件的优化

ECL信号会受到多种因素影响，包括pH值、电位扫描速率、模板分子洗脱时间和孵育时间，分别对此进行了考察，结果如图5所示.

图5（a）是pH值对ECL信号的影响.当pH值从6.0增加到7.4时，ECL信号逐渐增强;当pH=7.4达到峰值，pH值继续增加时，ECL信号减小.这是因为pH值较小时，有较多质子被还原，影响了g-C3N4还原;但在碱性环境中，OH-和K2S2O8又还原生成的硫酸根阴离子自由基（SO4·-），会抑制氮化碳阴离子自由基（g-C3N4·-）转化为激发态氮化碳（g-C3N4*）的过程，减少了激发态的g-C3N4*，导致ECL信号降低[16].因此，实验中选择pH=7.4.

图5（b）是电位扫描速率对ECL信号的影响.扫速从80 mV·s-1增加到100 mV·s-1，ECL值逐渐增大，扫率超过100 mV·s-1后，ECL值反而减小.这是因为扫速高则需要更多的K2S2O8参与电极反应，但此时溶液中的K2S2O8来不及扩散到电极附近，所以ECL值减小.因此，选择电位扫描速率为100 mV·s-1.

圖5（c）是不同洗脱时间的ECL信号.把MIP/g-C3N4NSs/GCE插入甲醇和乙酸混合溶液（体积比为9∶1）中进行洗脱，记录不同洗脱时间对应的ECL信号.可以看出，当洗脱时间从6 min增加到13 min时，ECL值不断变大，13 min后ECL信号几乎没有变化，说明MIP膜中的CPF已达到平衡状态，ECL信号已达到最大值.因此，选择模板分子CPF的洗脱时间为13 min.

图5（d）是对CPF重新孵育时间的优化.把除去模板分子CPF的电极重新插入含CPF（1.0×10-5 mol·L-1）的溶液中进行孵育，记录不同孵育时间对应的ECL信号.孵育时间4～14 min，ECL信号随时间增加不断减小，在14 min时降到最低，之后保持不变.因此，选择14 min作为最佳孵育时间.

2.5 传感器对CPF的ECL响应

在以上优化的条件下，检测传感器对不同物质的量浓度CPF的ECL响应信号，如图6所示.图6（a）是传感器对不同物质的量浓度CPF的ECL响应信号.随CPF浓度不断增加，ECL强度不断减小.图6（b）是ECL强度的变化值（∆I）与CPF物质的量浓度对数值（log C）之间的关系图，∆I与lg C在1.0×10-8～1.0×10-4 mol·L-1范围内呈现良好的线性关系.线性回归方程为∆I（I0-I）=1 464.55 lg C-518.66（R2=0.997 9），I0是无CPF溶液的ECL值，I是不同物质的量浓度CPF溶液的ECL值，C为CPF的物质的量浓度（nmol·L-1）.LOD为5.0 nmol·L-1（信噪比S/N=3）.与其他检测CPF的方法相比较，本方法具有较低的LOD和较宽的线性范围，如表1所示.

2.6 传感器的选择性、稳定性、重现性的考察

为了检测传感器对CPF的选择性识别能力，选取了其他几种常见的农药，包括辛硫磷、马拉硫磷、伏杀磷、阿维菌素和甲基对硫磷（物质的量浓度均为1.0×10-3 mol·L-1），考察传感器对它们的响应情况，结果显示传感器只对CPF（1.0×10-5 mol·L-1）产生响应，而对其他几种农药几乎没有响应，如图7（a）所示.由此证明传感器对CPF具有良好的选择性识别能力，这主要归功于传感器表面引入的MIP膜，为了进一步证明这一点，按照同样的条件制备了非分子印迹膜传感器——NIP-ECL传感器，并测试了它对目标分子CPF及以上非目标分子的ECL响应，结果显示NIP-ECL对所有分子都没有响应，说明NIP-ECL没有特异性识别能力，这一结果进一步证明了MIP对目标分子的特异性识别能力.

把传感器存于4 ℃环境中，每7 d测试一次ECL信号，连续测试28 d的ECL变化情况，如图7（b）所示，最后一次测试响应信号强度依然能达到初始值的96%.对同一个传感器连续进行10圈扫描，如图7（c）所示，ECL信号几乎没有变化.同样条件下，平行制备6个传感器，测其ECL，6个传感器的ECL信号的相对标准偏差（RSD）为2.4%，如图7（d）所示.这些结果证明制备的传感器具有良好的稳定性和重现性.同时，测试了传感器的再生能力，结果显示一个传感器可反复进行3次连续的洗脱和孵育，信号基本稳定.

2.7 实际样品中CPF的测定及回收实验

以生菜和芹菜作检测样品来评估所构建的MIP-ECL传感器的实际应用价值.样品预处理步骤：分别取生菜样品和芹菜品样品各10 g（购自上海沃尔玛超市），剪碎浸泡在25 mL的甲醇溶液中1 h，过滤后取上清液进行检测.采用标准加入法，测试结果如表2所示.回收率为96.0%～100.9%，RSD不超过3.1%.结果表明：所构建的传感器可用于实际样品中CPF的检测，具有实际应用价值.

3  结 论

以高效、低毒的g-C3N4NSs作为ECL材料，CPF作为目标分子，将高灵敏的ECL检测技术与高选择性的MIP技术相结合，成功构建了一个对CPF具有特异识别的MIP-ECL传感器.传感器对CPF的线性响应范围为1.0×10-8～1.0×10-4 mol·L-1，检出限（LOD）为5.0 nmol·L-1.该传感器不仅灵敏度高、选择性好，而且制作简单、成本低，拥有优异的稳定性和重现性，可用于蔬菜中CPF含量检测，结果令人满意.

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（責任编辑：郁慧，顾浩然）