超声辅助膜组合技术探索绞股蓝总皂苷部位的分离机制与精制模式

李存玉，邹雨岑，马 莉，侍 言，许启龙，彭国平*

超声辅助膜组合技术探索绞股蓝总皂苷部位的分离机制与精制模式

李存玉1, 2，邹雨岑1#，马 莉1，侍 言1，许启龙1，彭国平1, 2*

1. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023 2. 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023

基于超声与膜分离技术，探索绞股蓝总皂苷的分离机制与精制模式。以总蛋白、多糖、绞股蓝总皂苷、绞股蓝皂苷A、芦丁为指标进行综合评价，微滤-纳滤联用预处理去除大分子并浓缩药液，采用Box-Behnken中心组合设计，明确膜孔径、超声功率、pH值对皂苷及黄酮类成分超滤分离行为的差异性，探讨分离机制，设定分离目标，构建绞股蓝总皂苷部位的精制模式。微滤和纳滤组合预处理水提取液，可大幅度去除多糖和蛋白，提高浓缩液中总皂苷浓度；超声功率可以调控绞股蓝皂苷胶束状态，溶液碱化，促进包裹或嵌合在胶束中的芦丁溶出，构建了超声辅助超滤的绞股蓝总皂苷精制模式，皂苷类成分总转移率79.7%，其他考察成分均低于6%。成分存在状态与分离行为直接相关，以溶液环境和超声辅助调控皂苷缔合状态，构建精制模式，为中药皂苷类成分的常温化精制提供技术支撑。

皂苷；绞股蓝；膜分离；超声；芦丁；多糖；蛋白；精制；绞股蓝皂苷A；微滤；纳滤；Box-Behnken中心组合设计；转移率

绞股蓝始载于《救荒本草》，来源于葫芦科绞股蓝属植物绞股蓝(Thunb.) Makino的全草，具有健脾安神、补气生津等功效，其中绞股蓝皂苷具有抗肿瘤、保护心脑血管、保肝和抗氧化等功效，故有“南方人参”之称[1-5]。绞股蓝药材富含皂苷、黄酮、氨基酸等成分，采用溶剂提取、树脂富集的模式精制皂苷类成分，存在溶剂污染、分离周期长、热转化等技术瓶颈[6-7]。

膜分离技术分为微滤、超滤、纳滤和反渗透，通过跨膜压力差，依靠孔径、电荷等参数实现精制分离，具有常温操作、分离效率高等技术优势[8-10]。同时，皂苷类成分多具有类表面活性，在达到临界胶束浓度时，通过分子间缔合形成胶束[11]，胶束大小、物化性质等参数与其他类成分由明显区别，通过调控成分状态，放大差异，采用膜分离技术精制绞股蓝总皂苷，存在理论可行性，但科研探索尚处于初始阶段。本实验采用膜组合与超声耦合，动态调控皂苷胶束状态，以绞股蓝总皂苷、绞股蓝皂苷A为指标，定向去除多糖、蛋白、黄酮等小分子成分，优化分离参数，构建绞股蓝总皂苷部位的精制分离模式。

1 仪器与材料

Waters e2695高效液相色谱仪，PDA检测器，美国Waters公司；1812型Fogmachine膜分离设备，南京拓鉒医药科技有限公司；MS105十万分之一电子天平，瑞士Mettler Toledo集团；T6紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；GQ150管式离心机，宜兴市华鼎机械有限公司；KH-250B型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；PB-10型pH计，德国Sartorius公司。

绞股蓝购自安徽亳州市药材市场，产地陕西平利，批号20190601，经南京中医药大学药学院严辉副教授鉴定为葫芦科植物绞股蓝(Thunb.) Makino；对照品绞股蓝皂苷A（批号jbz0622，质量分数≥98%），南京金益柏生物科技有限公司；-无水葡萄糖（批号110833-201406，质量分数99.9%）、芦丁（批号100080-201409，质量分数≥91.9%），中国食品药品检定研究院；BCA蛋白含量检测试剂盒，江苏凯基生物技术股份有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，乙醇、硫酸、苯酚为分析纯，水为纯化水。膜组件规格参数见表1，星达（泰州）膜科技有限公司。

表1 膜组件规格参数

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 绞股蓝提取液 称取绞股蓝饮片50 kg，加入15倍纯化水提取2次，提取时间为1.5 h，滤液采用管式离心（15 000 r/min）去除不溶物，制得绞股蓝水提液。

2.1.2 绞股蓝皂苷A对照品溶液 精密称取干燥至恒定质量的绞股蓝皂苷A对照品4.99 mg置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，得质量浓度为0.499 mg/mL的绞股蓝皂苷A对照品溶液。

2.1.3 芦丁对照品溶液 精密称取干燥至恒定质量的芦丁对照品2.10 mg置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，得质量浓度为0.210 mg/mL的芦丁对照品溶液。

2.1.4 葡萄糖对照品溶液 精密称取干燥至恒定质量的-无水葡萄糖5.00 mg置于10 mL量瓶中，纯化水稀释至刻度，得质量浓度为0.500 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。

2.2 微滤-纳滤预处理

取孔径为0.1 μm微滤膜置于膜分离设备中，控制跨膜压力差低于0.1 MPa，采用纯化水循环清洗，取截留端及滤液端溶液。采用经过三点校正（pH 4.01、6.86、9.18缓冲液）的pH计测定截留端及滤液端溶液至显示中性（pH 7.0±0.1），排空膜组件及管道中残留纯化水。将绞股蓝水提取置于储液罐中，调节跨膜压力差在0.05～0.10 MPa，将截留端与进液端置于储液罐中，收集滤液端溶液，待储液罐中溶液体积无法维持分离时，储液罐中加入纯化水，待滤液端收集溶液达到原体积时，即完成微滤分离。

为了去除绞股蓝微滤液中小分子类成分，并进一步提高绞股蓝总皂苷浓度，调控溶液中胶束状态，选择孔径W600～800的纳滤膜进行分离，调节跨膜压力差在1.0～1.5 MPa，将截留端和进液端置于储液罐中，对绞股蓝微滤液进行纳滤分离，待纳滤浓缩液体积降至原体积1/3处时，采用纯化水补足体积至原体积，继续纳滤分离，重复操作3次，待浓缩液体积降至原体积1/3时，停止纳滤，收集纳滤浓缩液。

2.3 超滤精制分离

通过微滤-纳滤预处理，提升绞股蓝皂苷浓度促进胶束形成。选择超滤膜置于膜组件系统中，将2.0 L纳滤浓缩液置于储液罐中，调节超声波功率、跨膜压力差≤0.1 MPa，将截留端与进液端置于储液罐中，收集超滤液端溶液，待储液罐中溶液体积无法维持分离时，储液罐中加入纯化水，待滤液端收集溶液达到2.0 L时，即完成超滤分离。

单因素考察过程中，超滤膜孔径为截留W1000、5000、10 000、30 000、50 000；超声功率0、100、200、300、400、500、600 W、溶液pH值4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其中固定操作参数为超滤膜孔径截留W5000、超声功率100 W，pH值5.0。

为了纯化绞股蓝总皂苷，通过超声调控溶液中胶束缔合状态，以绞股蓝皂苷A、芦丁、总蛋白转移率为指标，结合膜通量参数，采用Design-Expert 8.06软件，分析超滤膜孔径（A，以截留W表示）、超声功率（B）、pH值（C）参数对分离精制效率的影响，实验方案见表2。

2.4 指标检测

2.4.1 总蛋白 参照BCA蛋白质浓度测定试剂盒操作规程[12]，测定待测样品中蛋白质量浓度，评价分离参数对蛋白质分离效果。

表2 超滤分离因素与水平

2.4.2 多糖 根据硫酸-蒽酮法[13]，精密量取葡萄糖对照品溶液0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL置于100 mL量瓶中，纯化水稀释至刻度，摇匀。精密吸取系列质量浓度葡萄糖溶液2 mL于10 mL具塞刻度试管中，各加入6 mL硫酸蒽酮溶液，摇匀，迅速置于冰水浴中冷却，然后置沸水浴中加热10 min后，再在冷水浴中冷却。于620 nm测吸光度（）值，以葡萄糖质量浓度（）为横坐标，值为纵坐标进行线性回归分析，绘制葡萄糖质量浓度与值标准曲线为＝0.014 4－0.000 2，2＝0.999 7，结果表明葡萄糖在10.00～25.00 mg/mL与值线性关系良好。该方法的精密度、重复性及加样回收率均符合要求，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 绞股蓝总皂苷 参考文献中检测方法[14]，以吸光度值为纵坐标（），绞股蓝皂苷A的质量浓度为横坐标（）进行线性回归，得回归方程为＝4.308 6－0.088 3，2＝0.999 6，结果表明绞股蓝皂苷A在0.06～0.21 mg/mL与值线性关系良好。该方法精密度、重复性及加样回收率均符合要求，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4 绞股蓝皂苷A 参考文献中色谱条件[15]，精密吸取绞股蓝皂苷A对照品溶液1、2、5、10、20、50 μL，高效液相色谱仪检测，以峰面积为纵坐标（1），对照品进样量为横坐标（1），绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程为1＝601 7281－ 35 681，2＝0.998 6，结果表明绞股蓝皂苷A在0.25～12.50 μg线性关系良好。该方法精密度、重复性及加样回收率均符合要求，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.5 芦丁 参考文献中色谱条件[16]，精密吸取芦丁对照品溶液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL分别置于5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，高效液相色谱仪检测，以峰面积为纵坐标（2），对照品溶液质量浓度为横坐标（2），进行线性回归，得线性回归方程为2＝15.722＋24.89，2＝0.999 3，结果表明芦丁在4.2～84.0 μg/mL线性关系良好。该方法精密度、重复性及加样回收率均符合要求，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.6 转移率计算 根据高效液相色谱法、分光光度法、试剂盒中操作规程，检测并采用标准曲线计算待样品中指标质量浓度，结合分离前后体积参数，分别计算转移率（T）、总转移率（T）。

T＝11/22

T＝T1T2…T

T1为步骤1的成分转移率，T为步骤的成分转移率，1和1为微滤液、纳滤浓缩液、超滤液中待测指标的质量浓度和体积，2和2分别为微滤、纳滤、超滤原液中待测指标质量浓度和体积。

超滤透过率采用转移率公式计算。

2.5 微滤-纳滤前处理对成分的影响

借助微滤与纳滤分离优势，指标性成分转移率见表3，分析发现微滤可以高效去除绞股蓝提取液中的蛋白与多糖，同时绞股蓝中皂苷、黄酮均可以透过微滤膜。基于纳滤分离的电荷排斥及孔径筛分原理，大分子蛋白较好的保存在浓缩液中，而多糖转移率下降，推测是小分子单糖、二糖、寡糖等容易透过纳滤膜孔，皂苷类成分得到较好的保留，黄酮类代表成分芦丁损失17.6%。

2.6 考察因素对指标性成分的影响

2.6.1 超滤膜孔径选择 如表4所示，在膜孔径为截留W5000～10 000，绞股蓝浓缩液中5种指标性成分透过率出现明显转折。经过微滤-纳滤前处理后，溶液中的蛋白和多糖均属于大分子类化合物，在系列孔径超滤膜中呈现出透过率缓慢上升的趋势。而绞股蓝皂苷类成分与芦丁在膜孔径为截留W1000、5000时，呈现出的透过率差异，主要由孔径筛分效应引起的[17]，也为绞股蓝浓缩液中黄酮与皂苷类成分的拆分提供了理论可行性。

表3 微滤-纳滤前处理对绞股蓝中指标性成分转移率的影响

表4 超滤膜孔径对成分透过率的影响

表5 超声功率对成分透过率的影响

2.6.2 超声功率考察 对比表5中超声功率对绞股蓝中成分的影响，其中绞股蓝总皂苷及绞股蓝皂苷A透过率与超声功率具有明显相关性，当功率高于200 W时绞股蓝皂苷透过率呈现出升高趋势，达到400 W后趋于稳定。同时，芦丁出现相似分离行为。通过超声处理，水溶液中的绞股蓝皂苷类成分存在状态发生改变，因单分子及低分子态皂苷比例增加，吸附在或嵌合在绞股蓝皂苷胶束中的黄酮类成分芦丁逐步释放至溶液中，容易通过超滤膜，引起透过率升高。

2.6.3 pH值考察 通过改变溶液酸碱度，调节黄酮类成分存在状态，进一步放大黄酮类成分与皂苷类成分的分离差异。分析表6中数据，pH值未对皂苷、蛋白和多糖的膜分离行为产生明显影响，而芦丁呈现透过率逐步升高的规律，是由于黄酮类成分在溶液中逐步离子化，降低成分表面能，以及与膜分离层的界面效应。芦丁W为610.52，pKa为6.17，当溶液中pH 8.0时，芦丁主要以离子态形式存在，理论上可以通过孔径为截留W5000的超滤膜，但透过率仅为71.4%，但仍有接近30%的芦丁未解离至溶液中，而难以通过超滤膜。

表6 pH值对成分透过率的影响

2.7 响应面法分离参数优化及显著性分析

基于单因素对指标性成分分离的影响，在截留W1000～10 000超滤膜中多糖、蛋白的透过行为相对稳定，同时绞股蓝皂苷A与绞股蓝总皂苷的分离行为相似，选择绞股蓝皂苷A和芦丁为指标进行参数优化。采用Design-Expert 8.06软件中Box- Benhnken中心组合设计原理，试验设计及结果见表7，方差分析见表8。

表7 超声辅助超滤的响应曲面设计与结果

表8 响应曲面二次回归模型的方差分析

对表8中绞股蓝皂苷A及芦丁的数学模型进行方差分析，其中所考察因素中膜孔径、超声功率对绞股蓝皂苷A分离行为影响显著，溶液pH值并不会引起绞股蓝皂苷胶束状态变化，对分离行为未产生显著影响。

绞股蓝皂苷A透过率与考察变量的回归方程为绞股蓝皂苷A透过率＝38.46＋36.97 A＋4.82 B－1.34 C－0.95 AB＋0.22 AC－6.83 BC＋15.37 A2＋0.49 B2－1.41 C2。回归方程模型＜0.000 1，模型高度显著，失拟项＝0.358 1，说明所构建的2次回归模型成立。多元相关系数2＝0.998 4，预测2＝0.986 0，调整2＝0.996 4，说明该模型可用于绞股蓝皂苷A的超滤分离行为预测与分析。

膜孔径、超声功率、pH值均对芦丁超滤分离有显著影响，芦丁透过率与考察变量的回归方程为芦丁透过率＝96.70＋6.81 A＋3.61 B＋3.89 C－2.01 AB－3.49 AC－0.20 BC－6.48 A2－1.87 B2－2.99 C2，2次回归模型＝0.000 2，模型高度显著，失拟项不显著（＝0.876 7），说明所构建的2次回归模型成立。多元相关系数2＝0.966 2，预测2＝0.976 7，调整2＝0.922 7，说明该模型可用于芦丁的超滤分离行为预测与分析。

2.8 绞股蓝皂苷与黄酮类成分的分离机制

分析考察因素与绞股蓝皂苷A的等位线图（图1），膜孔径为截留W3000时，随着超声功率的增加，绞股蓝皂苷A透过率升高趋势明显，而随着孔径增加，此现象并未加剧。说明缔合成胶束状态存在的绞股蓝皂苷，在相应超声功率作用下引起的空化和湍流效应[18]，溶液中单分子态、低分子缔合态比例增加，但仍是高分子胶束为主要状态。

对比芦丁的等位线图（图2），膜孔径、超声功率、pH值均对其透过率成正相关。当超声功率为400 W，pH值8.0时，芦丁在孔径截留W1000超滤膜中的透过率大于90%。而在pH值单因素考察时，截留W5000超滤膜中的透过率仅为71.4%。同时，超声功率、pH值对大分子蛋白、多糖的分离未产生明显影响，综合分析发现在超声功率和pH值协同作用下，芦丁从胶束中脱离并离子化，进而通过超滤膜，从而提高透过率。

图1 绞股蓝皂苷A考察因素相关性等位线图

图2 芦丁考察因素相关性等位线图

2.9 绞股蓝总皂苷部位精制模式

以绞股蓝总皂苷为指标，建立去除大分子及以黄酮类成分为代表的小分子成分，设定绞股蓝皂苷A透过率90.0%、芦丁透过率95%为目标值，采用Design-Expert 8.06软件优选参数为膜孔径截留W10 000、功率400 W、pH值7.8；同时，以绞股蓝皂苷A透过率15.0%、芦丁透过率90%为目标值，优选参数为膜孔径截留W1000、功率300 W、pH值7.9。

采用绞股蓝提取液进行验证，步骤1：0.1 μm微滤膜耦合截留W800纳滤膜前处理；步骤2：采用上述2步超滤耦合超声的分离模式进行分离，计算指标性成分的转移率，结果见表9。通过膜分离与超声耦合，结合成分物化性质差异进行系统拆分，其中目标成分绞股蓝皂苷的总转移率为79.7%，其他成分的转移率均低于6%。

分析绞股蓝皂苷类成分在精制过程中的含量变化，结果见表9。精制过程中，微滤、截留W10 000超滤环节对总蛋白和多糖含量影响明显。在精制模式下，固含物从102.18 g下降至22.91 g，除杂率为77.58%。绞股蓝总皂苷在固含物中占比由17.40%升高至61.81%，精制效果明显。

表9 精制模式下的成分转移率变化(, n = 3)

3 讨论

中药皂苷类成分的分离多采用树脂吸附、层析色谱等技术，在热处理、环境污染等方面存在一定的局限性。膜分离多用于溶液体系的预处理、除菌过滤，难以用于复杂体系中成分系统拆分。本实验根据成分物化性质，通过溶液环境、外加力场调控成分存在状态，放大成分分离行为差异，通过膜组合技术，构建的皂苷类成分分离模式，总固体除杂率77.58%，绞股蓝总皂苷含量提升3倍以上，在总固体中占比61.81%，但其中仍有与皂苷物化性质相似的成分，基于膜分离原理和应用的局限性，尚需进一步与色谱技术结合，进一步提升绞股蓝总皂苷纯度。

绞股蓝总皂苷部位具有较好水溶性，在亲水性材质膜组件中吸附行为不明显。但是在微滤过程中，经离心处理的绞股蓝提取液会引起膜污染，膜通量下降明显，通过控制跨膜压力差在0.05～0.10 MPa，降低膜面浓差极化效应。同时，微滤分离完成后，采用0.1%氢氧化钠水溶液清洗，膜通量可以恢复至95%以上，提示多糖、蛋白在膜表面形成的凝胶层为主要污染因素。

中药皂苷类成分多具有表面活性，在满足临界胶束浓度时，通过分子间氢键缔合形成胶束，以降低分子表面能，提高溶液稳定性。绞股蓝提取液中皂苷类成分胶束形成过程，也有黄酮类成分参与其中，本实验选择芦丁为绞股蓝黄酮的代表性成分，因水溶性差，容易通过吸附、嵌合或包裹的方式分布于绞股蓝皂苷胶束中，基于孔径筛分原理，以缔合态、分子态、离子态的芦丁呈现出差异性分离行为，采用溶液碱化和超声处理，促进了缔合态向分子态、离子态的转移，从而改善芦丁的超滤传质效率。然而，绞股蓝皂苷的胶束缔合机制，以及黄酮等其他类成分的参与规律尚不明确，限制了皂苷类成分的精制纯化和相应分离技术的应用。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Exploring separation mechanism and refined mode oftotal saponin by ultrasonic assisted membrane combination technique

LI Cun-yu1, 2, ZOU Yu-cen1, MA Li1, SHI Yan1, XU Qi-long1, PENG Guo-ping1, 2

1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing 210023, China

To explore separation mechanism and refined mode oftotal saponin by ultrasonic assisted membrane combination technique.In the experiment, total protein, polysaccharide,total saponin, gypenoside A and rutin were selected as indexes to evaluate comprehensively, microfiltration-nanofiltration pretreatment was used to remove macromolecules and concentrate solution. The differences of separation behavior between saponin and flavonoid were analyzed with Box-Behnken central composite experiment design, which contributed to clarify separation mechanism, set separation goals and establish the refined mode oftotal saponin.Experiments indicated that the polysaccharide and protein can be effectively removed by microfiltration-nanofiltration, while helping to form micelles of saponins in the concentrated solution. Rutin was dissolved from gypenosides micelles by regulating micelle state with ultrasonic power and ionizing with pH value. And then, the ultrasonic-assisted ultrafiltration model was constructed to refinetotal saponin, the total transfer rate of saponins was 79.7%, while other components under investigation were less than 6%.The separation behaviors of membrane were related to molecular state. Takingtotal saponin as an example, the refined mode was established by regulating solution environment and the associative state of saponins, and the results provided references for membrane concentrate for traditional Chinese medicine of saponins at room temperature.

saponin;(Thunb.) Makino; membrane separation; ultrasonic; rutin; polysaccharide; protein; refine; gypenoside A; microfiltration; nanofiltration; Box-Behnken central composite design; transfer rate

R283.6

A

0253 - 2670(2021)01 - 0091 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.012

2020-09-18

国家自然科学基金资助项目（82074006）；国家自然科学基金资助项目（81503258）；2020年国家级大学生创新创业训练计划项目（202010315037）

李存玉（1985—），男，博士，副教授，研究方向为中药制药。Tel/Fax: (025)86798186 E-mail: licunyuok@163.com

彭国平（1963—），男，博士，教授，博士生导师，主要从事中药制剂精制及新药研究。Tel/Fax: (025)86798186 E-mail: guopingpeng@126.com

#共同第一作者：邹雨岑（1999—），女，本科生，研究方向为中药资源与开发。Tel: 19805187190 E-mail: 924966594@qq.com

[责任编辑 郑礼胜]