光谱重构油菜叶绿素含量快速检测方法及设备研制

翁海勇，黄俊昆，万 亮，叶大鹏*

1. 福建农林大学机电工程学院，福建 福州 350002 2. 浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058

引 言

叶绿素是植物最重要的色素之一，是判断植物健康状态的重要指标[1]。当植物遭受生物和非生物胁迫时，叶片中的叶绿素含量会随之改变。因此，叶片中叶绿素含量的快速检测对植物健康状态的诊断具有重大的现实意义。传统上，叶绿素含量的测量主要采用紫外分光光度法，虽然结果准确可靠，但是操作繁琐，属于离线测量，结果滞后，并且产生一系列化学废弃液，污染环境，无法满足现代农业对植物健康状态精准高效监测的需求。

光学技术因其无损、快速、高效等优点在作物生理状态监测中具有重要的应用前景。有学者根据叶绿素对不同波长的光的吸收率不同的原理开发了手持式相对叶绿素测量仪[2]和绝对叶绿素检测仪[3-5]。上述设备成本低廉，操作方便，但是属于单点测量，不同测量点之间数据波动性较大，也无法反映叶绿素在整个叶片分布的情况，并且检测的结果也会受到叶片厚度和类型变化的影响。张建等[6]利用普通单反相机搭载滤波片的方式拍摄了水稻叶片的可见光和近红外图像，实现了叶片SPAD的测量。虽然SPAD值与叶绿素浓度存在较好的相关性，但对于不同类型的植物叶片，其SPAD值与叶绿素浓度之间的关系模型却不尽相同[7]。由于光谱成像技术同时获取了光谱信息和图像信息，能够实现植物生理状态和养分分布的可视化表达。石吉勇等[8]应用高光谱成像提取了整个叶片的平均光谱并建立遗传偏最小二乘叶绿素校正模型，实现了叶绿素在黄瓜叶片表面的分布，为黄瓜的长势状态提供了有效的参考信息。甘海明等[9]结合高光谱成像技术和深度学习实现了龙眼叶片叶绿素含量的预测，为龙眼的生长状况及养分分布提供理论依据。Feng等[10]利用高光谱成像技术实现不同生长期水稻叶片叶绿素含量的快速检测，实现了水稻生长状况的快速诊断。Shi等[11]获取了黄瓜叶片的近红外高光谱图像，结合多元线性回归模型实现了叶绿素含量的快速检测。与非成像的手持式叶绿素检测仪相比，上述成像设备虽然能够准确地获取到叶绿素浓度及其在叶片空间的分布情况，但是仪器设备成本高，体积大，无法被大面积推广使用。

鉴于上述情况，有必要开发一款体积小、成本低廉、操作简便、结果可靠且能够使叶绿素含量在整个叶片可视化表达的手持式设备。因此，以油菜为研究对象，采用自主研发的手持式多光谱成像系统采集油菜叶片的多光谱图像，融合光谱重构技术，提高光谱分辨率，以期提高模型对叶绿素含量的反演能力，从而为油菜的生理状态以及养分的精准化管理提供理论依据。

1 实验部分

1.1 油菜叶片采集

油菜来源于浙江省杭州市西湖区浙江大学紫荆港校区西区试验田。油菜品种为浙大630，物候期为苗期。试验田分成三个试验小区，每个小区地块面积为6.4 m×24.4 m，三块小区的氮肥(尿素)施肥量分别为75, 150和225 kg·ha-1，磷肥(过磷酸钙)和钾肥(氯化钾)的施用量均分别为60和150 kg·ha-1。尿素在12月中旬和来年2月份中旬施肥，磷酸钙和氯化钾则在油菜种植前施一次。为了使试验数据分布范围尽可能大，在采样过程中分别从每个小区内采集100片(共300片)不同叶绿素含量的油菜叶片作为研究对象。

1.2 多光谱和高光谱图像采集

为了实现油菜叶片叶绿素的快速无损精准检测，本文开发了便携式多光谱成像系统，用于油菜叶片多光谱图像的采集。该设备主要包含了分辨率为480×640 pixels的单色黑白CMOS相机(MT9V032, ON Semiconductor, Phoenix, Arizona, USA)，光源LED(Epileds Technologies, Inc, Taiwan, China)、镜头(M0814-MP, CBC Corporation, Tokyo, Japan)和上位机软件[图1(a)]。在绘制电路板时，每个波长的LED安装3个，间隔为120°[图1(b)]。六个波段LED的中心波长分别为460，520，660，740，840和940 nm，半带宽均为25 nm[图1(c)]。上位机软件依次触发不同波长LED的驱动电路，从而依次点亮对应波长的LED，此时相机采集对应波段的光谱图像，构成多光谱图像立方块[图1(d)]。为了实现光谱重构，提高光谱分辨率，本试验选取了室内高光谱成像系统作为参考仪器[图1(e)]。高光谱成像系统主要由分辨率为672×512 pixels的CCD相机(C8484-05, Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japan)、线光源(Fiber-Lite DC950, Dolan Jenner Industries Inc., Boxborough, MA)、波长范围为379～1 023 nm、分辨率为2.8 nm的光谱仪(ImSpector V10E, Spectral Imaging Ltd., Oulu, Finland)、电控移动平台、暗箱和电脑。为了使样品的多光谱和高光谱图像一一对应，利用打孔器从叶片上取下面积为50 cm2的圆盘叶片用于光谱图像采集，并将整个叶片圆盘作为感兴趣区域(region of interest, ROI)，用于提取平均光谱。多光谱图像的采集参数为物镜距离30 cm，曝光时间为35 ms，高光谱图像的采集参数则为物镜距离30 cm，曝光时间为30 ms，平台移动速度为1.0 mm·s-1。在油菜叶片的高光谱和多光谱图像采集前，首先获取参考板和暗电流的光谱图像数据，用于数据处理前原始光谱图像的校正，以减少光照不均匀和暗电流对光谱图像的影响，校正公式为

图1 手持式多光谱成像系统(a)、不同波长LED的布局(b)、各个LED的中心波长(c)、 上位机软件(d)及室内高光谱成像系统(e)

(1)

式中，R为校正后的光谱图像，Idark为暗电流图像，Iraw为原始光谱图像，Iref为参考板光谱图像。

1.3 叶绿素含量测定

在光学图像采集后，采用传统方法测量叶片中叶绿素含量[12]。将上述50 cm2的圆盘叶片浸泡在装有8 mL 95%乙醇的离心管中。黑暗环境中静置24 h后，使用酶标仪 (Epoch2, BioTek Instruments, Inc, Vermont, USA)测量叶绿素溶液在470，649和665 nm的吸光度值(A470，A649和A665)，用于计算出叶片中叶绿素的浓度。

1.4 光谱重构

光谱重构技术是将目标物低维的光谱值恢复高维的光谱值，达到提高分辨率和检测精度的目的。采用伪逆法求解转换矩阵实现多光谱向高光谱重构，转换矩阵的求解过程如式(2)—式(4)[13]

Xms=XssF

(2)

(3)

Xss,c=Xss,uF

(4)

1.5 预测模型的建立与评价

2 结果与讨论

2.1 光谱反射率分析

应用室内高光谱成像系统和手持式多光谱成像系统所测得所有油菜叶片的平均光谱反射率曲线如图2(a)和(b)所示。分析图2(a)和(b)可知，两台仪器测得油菜叶片平均反射率的绝对值不同； 原因可能由于两者的传感器响应(室内高光谱成像系统用的是CCD，而手持式多光谱成像设备用的是CMOS)存在差异引起的。然而进一步分析可知，两台设备测得的叶片的平均光谱曲线趋势一致，表现为因叶绿素和类胡萝卜素吸收引起的在蓝光(460 nm)和红光(660 nm)区域出现的波谷，叶片反射绿光在520 nm引起的绿色反射峰。因“红边”效应引起的在660～740 nm波长范围内的反射率急剧上升。由于植物对近红外光几乎不吸收，导致近红外区域(740～940 nm)的反射率较高。图2(c)显示了重构的和室内高光谱成像系统所测的所有样品在430～1 023 nm内的高光谱反射率。分析图2(c)可知，重构的油菜高光谱反射率和室内高光谱成像系统所测的高光谱反射率基本上处于相同的数值区间。对比分析可见光(430～740 nm)和近红外(740～1 023 nm)区域的重构效果可以看出，重构的光谱反射率与室内系统获得的光谱反射率在可见光区域的重叠度高于近红外。这可能是由于相机传感器在可见光范围内的量子效率优于近红外。图2(d)显示了所有样本重构的光谱反射率和室内高光谱成像系统测得的光谱反射率两者之间的相关性系数(r)均可达到0.99以上，说明了伪逆法能够实现多光谱向高光谱的重构。

2.2 校正模型的预测性能分析

2.3 光谱重构的效果评价

图2 室内高光谱成像系统获得的所有油菜叶片的平均光谱反射率(a)，手持式多光谱成像系统测得的所有油菜叶片的平均光谱反射率(b)，重构的高光谱反射率和室内高光谱成像系统测得的叶片高光谱反射率(c)，重构的光谱反射率和室内高光谱成像系统测得的叶片光谱反射率之间的相关性系数(d)

图3 基于室内高光谱成像系统获得的可见光范围内225个波段光谱反射率(a)和手持式多光谱成像系统获得的可见光范围内4个波段光谱反射率建立的叶绿素PLSR模型的预测性能

图4 不同标样集个数对PLSR模型预测性能的影响(a)和标样集为5时重构得到的光谱建立的PLSR模型的预测效果(b)

3 结 论