聚多巴胺原位还原银纳米增强碳点荧光自组装纳米复合膜用于检测葛根素研究

翁文婷，王思玉，庄君阳

泉州师范学院化工与材料学院，福建 泉州 362000

引 言

葛根素(Pueraria，Pue)亦称为葛根黄素。是我国传统名贵中草药葛根中分离出来的一类异黄酮类衍生物。葛根素具有退热、镇静和使冠状动脉血流量增加的作用，临床上可用于提高免疫、增强心肌收缩力，保护心肌细胞，降血压等作用。近几年研究发现葛根素对肝损伤修护和骨质疏松症的抑制也有很好疗效[1-2]。葛根素在血管疾病治疗中有重要性，准确测定葛根素含量可保证葛根素制剂的药品质量。葛根提取物的含量测定收录于在《中华人民共和国药典》(2015年版)(一部)，为高效液相色谱法[3]。此方法虽灵敏，但是仪器设备昂贵、操作繁琐且需使用大量溶剂。采用其他色谱方法测定葛根素的含量，均是建立在葛根素的紫外吸收特性的基础上，检测灵敏度受限。也有报道主要采用联用技术来实现葛根素的快速灵敏检测[4]。但这些方法均存在仪器条件要求较高或检测干扰较大等问题。寻找操作简单，稳定性高和线性范围宽的葛根素检测方法具有重要意义。

荧光光谱分析法仪器设备简单，操作简便，灵敏度高。利用葛根在弱碱性溶液环境下的弱荧光性质可以实现对其含量的直接荧光分析检测，结合固相萃取前处理方法可采用高效液相色谱法明显提高检测灵敏度，用于体内样品中药物含量的检测[5]。然而，葛根素是一种弱荧光物质，其内源荧光很弱。当外界条件发生改变，如在不同酸度、不同溶剂中以及入射光源的波长等，都会导致葛根素荧光强度的变化，影响到检测方法的稳定性。为此，人们转向研究采用荧光探针间接测定葛根素含量的新方法。

随着纳米技术的发展，光学性能稳定、表面积大、制备工艺简易且水溶性良好的量子点荧光探针的出现，为研发低成本，低污染的中药成分检测方法提供良好的手段。Qu等[6]以量子点结合免疫色谱法定量检测葛根素，检测限为5.8 ng·mL-1。Zhang等[7]将CdTe量子点结合石墨烯制备纳米复合材料作为葛根素的快速响应和高灵敏的电化学传感器。Fan等[8]利用氧化石墨烯引发鲁米诺的强化学发光，随后信号被葛根素抑制而建立化学发光(CL)方法测定中药材和人尿样中葛根素的含量。

基于廉价环保的碳点构建荧光传感薄膜的方法罕见报道，可能是归因于组装薄膜上的量子点密度小，发光强度弱，不利于响应信号检测的缺陷。研究表明，金属银纳米结构的表面等离子体局域电磁场可激增特定距离处发光体的信号，即表面增强荧光(surface enhanced fluorescence, SEF)效应，并成功应用于表面增强拉曼光谱[9]和荧光光谱。结合具有粘附性能和还原特性的聚多巴胺，可在光滑的玻璃表面获得增强因子高、重复性和稳定性好的银纳米基底[10-13]。

本文以胱氨酸和柠檬酸为碳源，采用水热法制备的荧光碳点(fluorescent carbon dots, FCDs)为研究探针。利用多巴胺碱性溶液的自聚成膜过程中同步还原硝酸银，在FTO导电玻璃上形成聚多巴胺(Polydopamine, PDA)复合银纳米(Ag nanoparteles, AgN)基底(FTO/PDA-AgN)。通过荧光光谱、紫外光谱、交流阻抗与循环伏安曲线等方法优化PDA-AgN复合膜的制备条件，探讨银纳米对荧光碳点的增强效应。构建的FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs相比于未引入银纳米的薄膜荧光增强近3倍。葛根素的加入引起传感膜外层碳点的荧光猝灭，由此建立荧光传感膜对葛根素的检测响应，线性回归方程为I0/I=2.843×104cPue+1.068，相关系数r=0.9985 6，检出限LOD=2.31×10-7mol·L-1(3 SD/K)。相比于非银纳米增强型荧光传感膜体系的检出限降低了1个数量级。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Cary eclipse荧光分光光度计(美国Varian公司)； UV-2600紫外-可见分光光度计(日本Shimazu公司)； F-7000荧光分光光度计(日本Hitachi公司)； FLS920荧光光谱仪(英国Edinburgh Instruments)； TECNAI G2 Spirit TWIN 场发射透射电子显微镜(美国FEI公司)； S-4800扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)； ZetaPALS Zeta电位及粒径分析仪(美国布鲁克海文仪器公司)； EscaLab 250XiX-射线光电子能谱仪(美国赛默飞电子公司)； Freezone 6plus真空冷冻干燥机(美国LABCONCO公司)； DHG-924OA电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏设备有限公司)。

L-胱氨酸(cystine, Cys)； 柠檬酸(citric acid, CA)； 多巴胺(dopamine, DA)； AgNO3； 三羟甲基氨基甲烷(Tris[hydroxymethyl]metyl aminomethane; Tris)； 聚二烯二甲基氯化铵(Poly[dimethyl diallyl ammonium chloride], PDDA)均为分析纯，购自阿拉丁试剂有限公司； 聚苯乙烯磺酸钠(polystyrene sulfonate, PSS)购自美国Acros试剂有限公司； 葛根素标准品购自上海如吉生物科技有限公司； 导电玻璃FTO(10 mm×20 mm，武汉晶格太阳能科技有限公司)； 其余的试剂均为分析纯； 试验所用的水为超纯水。电化学实验采用三电极体系： 以组装膜为工作电极，铂片电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。

1.2 方法

1.2.1 荧光碳点的制备和表征

称取0.30 g胱氨酸和0.06 g的柠檬酸，用超纯水定容至6 mL，转移至聚四氟乙烯内衬的水热反应釜中，置于电热恒温干燥箱，于180 ℃下反应7 h，制备的荧光碳点记录为FCDs。合成后的碳点溶液在10 000 r·min-1的转速下离心10 min。收集上清液转入透析袋连续透析24 h (截留分子量为500 Da)，以去除过量的前躯体。最后，用0.2 μm的聚四氟乙烯微孔滤膜对透析液进行过滤处理，得到纯化的FCDs溶液。将溶液冷冻干燥，得淡黄色粉末。准确称取固体粉末，用超纯水配制为0.01 g·L-1溶液，置于冰箱中保存，用于光谱测定。

将上述碳点粉末在X射线光电子能谱仪上进行基团分析，采用X射线源，能量步数为181，AlKα激发。取透析处理后的荧光碳点溶液滴到铜网的多孔碳膜上，烘干后，采用场发射透射电子显微镜观察碳点的形貌，加速电压为40～120 kV，放大倍率为10～50万倍。所得图像使用Nano measure软件分析处理。用Zeta电位仪(He-Ne激光器激发)表征碳点在溶液中的表面电荷状态和水合粒径。将碳点溶液置于荧光分光光度计上测量荧光光谱。设置测量参数如下： Ex=350 nm； ExSlit/EmSlit=5.0 nm/5.0 nm； 发射光谱扫描范围： 360～600 nm； Scan rate=1 200 nm·min-1。用FLS920型稳态/瞬态荧光光谱仪测试碳点的荧光量子产率和荧光寿命。荧光量子产率采用积分球相对法拟合而得。采用nF920纳秒灯为激发光源，使用双指数函数对荧光寿命曲线进行拟合如式(1)

Y(t)=A1exp(-t/τ1)+A2exp(-t/τ2)

(1)

式(1)中：A1和A2对应的是1和2个过程中时间分辨衰减权重；τ1和τ2分别为第1和2个过程的寿命。

最终荧光寿命值按如式(2)计算

(2)

1.2.2 PDA-AgN复合膜的制备及表征

聚多巴胺原位还原银纳米复合膜的制备过程如图1所示，将FTO玻片导电面朝上平铺在培养皿中，分别用丙酮、超纯水、无水乙醇溶液没过玻片表面，超声洗涤10 min，保证表面洁净，浸入新制Piranha溶液(98% H2SO4∶30% H2O2=7∶3,V/V)超声洗涤30 min，最后用超纯水多次超声清洗，氮气吹干。

准确移取1 mL DA水溶液加入5 mL pH 8.5的Tris-HCl缓冲溶液，再用纯水定容至10 mL为组装液。缓慢加入培养皿中，没过玻片表面，常温下静置5 h，形成FTO/PDA膜。取出用氮气吹干后，加入3.0 g·L-1的硝酸银水溶液没过FTO/PDA基底的表面，置于通氮除氧的环境组装2 h，取出用氮气吹干，制得FTO/PDA-AgN复合膜基底，置于真空干燥器保存。

以FTO/PDA作为空白，以FTO/PDA-AgN为样品，扫描200～800 nm范围内AgN的吸收光谱。用扫描电子显微镜放大1万倍进行形貌观察，电压1.0 kV。分别以FTO，FTO/PDA和FTO/PDA-AgN为工作电极，置于含有5 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1 mol·L-1KCl底液中，扫描频段为0.01 Hz～100 kHz，振幅为0.005 A条件下进行电化学交流阻抗谱实验。使用ZSIMDEMO软件拟合电子传递Ret。并以100 mV·s-1扫描速度于-0.6～1.0 V进行循环伏安曲线扫描。计算还原峰电位值Epc和氧化峰电位值Epa，两者之差记为ΔEp。

1.2.3 表面增强荧光传感膜的制备及表征

增强型传感膜制备及对葛根素的响应流程如图1所示，将FTO/PDA-AgN放入1% (V/V) 的PDDA溶液中组装1 h，取出后用超纯水清洗，恒温恒湿箱中晾干； 再置于1 g·L-1的PSS溶液中组装1 h，同样操作进行清洗和晾干； 重复该过程n次，就得到FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]n自组装膜。再浸入在荧光碳点溶液中3 h，取出后用氮气吹干后即得到荧光增强传感膜FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]n/FCDs。

采用S-4800扫描电子显微镜进行表面形貌分析，扫描电压1.0 kV。激光共聚焦显微图片采用Leica TCS SP8激光共聚焦荧光显微镜进行测试，根据碳点的最佳荧光发射波长选择405 nm激发光源。用自制玻片固定装置将荧光自组装膜样品固定于石英四面比色皿内，调整合适的角度，使玻片组装面与入射光的夹角约为50°，进行荧光光谱测定。荧光光谱和荧光寿命曲线的扫描参数同1.2.2。

图1 聚多巴胺原位还原银纳米荧光增强型自组装膜的构建及葛根传感示意图Fig.1 Schematic illustration of fabrication strategy of SAMs for detection of Pueraria

1.2.4 葛根素含量的检测

通过优化实验表明传感膜在中性液体环境中较为稳定，结合前期碳点的性能实验结果。选择pH 7.20的Tris-HCl缓冲溶液为液体环境。将FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs玻片固定于2 mL缓冲溶液的荧光比色池中，待膜的荧光信号稳定后，用微量进样器依次加入不同浓度的葛根样品待测液，并混匀，稳定5 min后，测荧光光谱。同时，按照上述步骤对FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs进行对照试验。

2 结果与讨论

2.1 荧光碳点的制备及表征

按实验方法制备并纯化碳点溶液进行紫外光谱和荧光光谱扫描，结果如图2(a)所示，FCDs水溶液的最大紫外吸收峰出现在330 nm。荧光光谱的最佳荧光激发发射峰为Ex/Em=350 nm/430 nm，溶液在紫外灯下呈现明亮的蓝色荧光。改变不同波长的激发光源，该碳点的发射峰位置在短波光源下较为稳定，在大于最佳激发波长的光源照射下发生明显红移。碳点溶液的性能测试结果表明，在pH 6～11范围内都呈现稳定的荧光发射，但是在pH小于5.0条件下荧光强度急剧下降并且发射峰位置发生了20 nm的移动，说明该碳点不适合在较酸性的溶液环境中稳定存在，这将为后期荧光膜的组装条件提供参考。FCDs的荧光衰减曲线采用双指数函数拟合后平均荧光寿命约为(10.75±0.08) ns，见图2(b)所示。同时，测得荧光量子产率可达到61.7%。这些光谱特性与文献报道的N，S掺杂碳点的实验结果相似[14]。

图2 FCDs溶液的(a)紫外-可见吸收光谱，荧光光谱和(b)荧光衰减曲线Fig.2 (a) The fluorescence, UV-Vis absorption spectra and (b) Decay curve of FCDs solution

图3 FCDs的(a) XPS全谱，(b) C(1s)谱，(c) O(1s)谱，(d)N (1s)谱，(e) S(2p)高分辨XPS能谱和 (f)透射电镜图像； 内插图为FCDs所对应的粒度分布直方图

为了进一步探究碳点的结构组成，采用XPS、TEM和粒度仪对碳点进行形貌表征。结果表明，碳点在水溶液中表面呈现负电荷状态。XPS电子能谱表征结果如图3(a—e)所示，分别在283.98，399.98和529.98 eV处出现代表C(1s)，N(1s)和O(1s)的特征峰。CDs中所含C，N，O和S元素组成的比例，说明胱氨酸的氨基和巯基在碳点合成过程中嵌入碳点表面N、S掺杂型的CDs。TEM是碳点形貌的最常用表征手段，将纯化后的碳点溶液滴加在铜网上，并用红外灯将其烘干，对其进行了透射电镜的表征。从图3(f)可以看出，碳点的分散性很好，大小均一并具有类球状形貌。内插图显示的是，经高斯曲线拟合得到的颗粒分布图(计算约100个纳米颗粒的平均值)，碳点的平均粒径约为2.45 nm。

2.2 FTO/PDA膜组装条件优化及表征

按照实验方法配制碱性多巴胺溶液，测试其光谱变化，跟踪其自聚合过程。实验结果如图4(a)和(b)所示，多巴胺单体在228和278 nm处有精细结构的紫外吸收峰，并且在320 nm处呈现蓝色荧光发射峰。多巴胺分子在碱性溶液环境中，容易自身氧化成醌结构，进一步环化后成吲哚类聚合物，导致紫外吸收峰消失。对应形成的聚多巴胺膜也没有荧光特性，不会对后期荧光自组装膜体系造成背景干扰，说明多巴胺在固体表面上形成基底膜的可行性和稳定性。

分别以FTO和FTO/PDA为工作电极，测试PDA膜的循环伏安和交流阻抗曲线。结果如图4(c)和(d)所示，PDA膜形成前后的电化学性质有明显不同，循环伏安曲线的氧化还原峰的电位差ΔEp变大，对应的Nyquist图上高频区半圆增大，表明形成的聚多巴胺膜阻碍的溶液中[Fe(CN)6]3-/4-的电荷传递到电极的过程，进一步表明了FTO/PDA膜的形成。通过电化学实验结果优化组装条件，确定在pH 8.5 Tris-HCl缓冲溶液的2.0 g·L-1多巴胺溶液中，浸泡3 h后，就可形成稳定的聚多巴胺薄膜。

2.3 FTO/PDA-AgN膜组装条件优化及表征

在FTO/PDA膜的基础上，按照实验方法制备FTO/PDA-AgN，通过扫描电镜和紫外吸收曲线跟踪膜上AgN的形成过程。结果如图5(a)所示，随着浸泡硝酸银溶液的时间延长，形成的聚多巴胺复合银纳米膜在440 nm的紫外吸收峰位置发生蓝移，并且吸光度逐渐增强，6 h时在430 nm处具有最窄的峰型。银纳米的紫外吸收峰均说明此时形成银纳米颗粒粒径分布最为均匀[13]。同样的实验也设计进行不同银离子浓度的优化，并考察聚多巴胺膜的形成条件对银纳米的粒径分布的影响。按照实验方法，在此基底上制备增强型自组装膜FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs，其荧光光谱结果如图5(b)所示，当浸泡为6 h时，膜的荧光强度也达到最大。因此，结合膜的荧光增强效应，优化可得FTO/PDA-AgN膜的最佳形成条件是将FTO/PDA在3 g·L-1的AgNO3溶液中浸泡6 h。对应的扫描电镜图片及其能谱分析如图5(c)和(d)所示，进一步验证了银离子在聚多巴胺膜上原位还原，形成纳米Ag颗粒。连续10 h观察银纳米的紫外光谱，吸收峰位置没有发生明显变化，说明此方法制得的纳米Ag颗粒具有较好的稳定性。

图4 pH 8.5 Tris-HCl溶液中1.0 g·L-1 DA溶液和聚多巴胺膜的(a)紫外-可见吸收光谱和 (b)荧光光谱图及成膜前后的(c)循环伏安曲线与(d)交流阻抗图

2.4 荧光增强膜的组装及机理研究

根据实验方法，通过PDDA和PSS聚电解质分子的静电吸附作用，将引入银纳米前后的基底进行层层自组装，构建不同聚电解质间隔层数的荧光增强膜FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]n/FCDs和FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]n/FCDs(n代表PDDA/PSS双层膜的层数)。荧光光谱结果如图6所示，随着组装间隔层数的增加，制备的自组装膜的荧光强度也增加，当n=3层时，相比于FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs自组装膜，FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs的荧光强度增强效果最明显，表明银纳米基底对碳点荧光信号的增强效应呈现出一定的距离依赖性。

通过激光共聚焦显微镜对增强型自组装膜进行荧光信号表征。实验结果如图7(a)和(b)所示，在同一条件下，引入银纳米的FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs SAMs的发光性能明显强于FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs SAMs。

将这两种自组装膜进行荧光寿命的验证。荧光衰减曲线如图7(c)所示，通过拟合计算，FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDsSAMs的荧光平均寿命为6.084 ns，而FTO/PDA-AgN/[PSS/PDDA]n/CDsSAMs的荧光寿命仅为2.983 ns。说明银纳米基底对碳点荧光信号的增强也伴随着辐射衰减率的增加。由此，可推测银纳米对碳点荧光增强机理如局域表面等离子体共振效应的作用。

2.5 荧光增强膜对葛根药物的传感分析

由于葛根分子对传感膜上碳点的荧光信号具有猝灭效应，按实验方法建立FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs测定葛根含量的分析方法。结果如图8(a,b)所示，在3.33×10-7～1.50×10-5mol·L-1范围内，荧光信号猝灭程度与加入的葛根标准品浓度呈良好的线性关系，测定的线性方程为I0/I=2.843×104cPue+1.068，相关系数为r=0.998 56。检出限为2.31×10-7mol·L-1(3 SD/K)，其中K为工作曲线的斜率2.843×104，RSD为10次空白试验值0.218 9%。检测灵敏度相比于FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs的线性响应方程为I0/I=2.625×103cPue+0.949 9 (r=0.988 49)，检测限提高了近一个数量级。

图6 不同间隔层数条件下制备的FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs(红色)和 FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs(黑色)自组装膜的荧光光谱图Fig.6 The fluorescence spectra of FCD-adsorbed SAMs with (red) and without (black) AgN as a function of spacer (PDDA/PSS)n (n=1～5) bilayers

图7 (a) FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs，(b) FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs自组装膜的激光共聚焦显微图片及(c)荧光衰减曲线

图8 (a) FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs对葛根素的荧光传感分析； (b) FTO/PDA/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs(黑)和FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs (红)传感膜的线性拟合曲线

3 结 论

以胱氨酸和柠檬酸为碳源，采用180 ℃一步水热法合成氮硫掺杂结构的碳点。该蓝色荧光碳点呈内径约3 nm的球状结构，并具有61.7%的高荧光量子产率。借助碱性多巴胺的粘附性能和还原性能，在聚多巴胺膜形成过程中同步进行银离子的化学还原，得到聚多巴胺复合银纳米基底。此法操作简易，相比于溶液相制备银纳米方法，可有效弥补纳米粒子易团聚氧化的缺陷。以水热法合成N, S掺杂的蓝色荧光碳点作为研究对象，采用自组装技术精确控制基底和FCDs之间的距离，构建的增强荧光型传感薄膜FTO/PDA-AgN/PDDA/[PSS/PDDA]3/FCDs，银纳米膜表面的碳点荧光信号增强了近三倍。荧光增强现象呈现出明显的距离依赖性，并导致辐射衰减率的增加, 荧光寿命明显降低。可推测银纳米对膜表面碳点的荧光增强是基于金属纳米的局域等离子体共振效应。荧光增强型传感膜可用于测定葛根药物的含量，检出限为2.31×10-7mol·L-1，相比无银纳米的荧光传感膜的检出限4.216×10-6mol·L-1，检测灵敏度提高了近一个数量级。