miR-24-3p靶向PDCD5减轻缺氧/复氧诱导心肌细胞损伤的作用机制

郑凤龙 任喜尚 杨洁

(郑州澍青医学高等专科学校临床医学系，河南 郑州 450064)

急性心肌梗死(AMI)的青年患者数量逐年递增，且男性患者比例较大〔1〕。AMI幸存患者1年后的发病率和死亡率仍高于普通人群〔2〕，而AMI的治疗会引发心肌缺血再灌注损伤(MIRI)，如何避免和减轻MIRI是临床亟需解决的问题，也是AMI临床研究的热点。研究表明，miRNA在心脏病和心力衰竭等过程中也存在调控作用，miRNA可能通过改变关键的信号分子，为MIRI提供潜在的治疗靶点和心肌损伤标志物〔3，4〕。MiR-24主要功能是调节细胞生长与凋亡，参与细胞分化及肿瘤的发生和发展〔5〕。研究表明，心肌梗死后miR-24在心肌组织中表达降低，抑制梗死后心肌细胞的凋亡，改善心肌功能〔6〕。程序化细胞死亡因子(PDCD)5是一种促凋亡基因，在H2O2处理的心肌细胞中表达上调〔7〕。但两者在心肌细胞中的作用机制尚不清楚。本课题以大鼠心肌细胞H9c2为研究对象，建立缺氧/复氧(H/R)模型，研究 miR-24-3p对H/R诱导H9c2细胞损伤、凋亡的分子机制，探讨PDCD5在此机制中的作用，为MIRI的治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1材料 大鼠心肌细胞H9c2购自ATCC；胎牛血清(FBS)和高糖/低糖DMEM培养基购自Gibco公司，胰蛋白酶Trypsin购自Sigma-Aldrich公司；乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；双荧光素酶报告系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)购自美国Promega公司；Total RNA提取试剂盒、 real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自宝生物工程(大连)有限公司；抗PDCD5、抗Bcl-2、抗Bax和抗Cleaved-caspase-3抗体购自Abcam公司；双染色流式法细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司；流式细胞仪购自BD公司，光学显微镜、全自动酶标仪及Real-time PCR仪购自美国bio-rad公司。

1.2细胞培养 在含有10% FBS、1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基中培养H9c2细胞，置于37℃、5% CO2恒温密闭培养箱中培养，湿度95%。待细胞生长至对数生长期时，洗涤消化传代。

1.3细胞H/R模型构建和实验分组 H/R模型建立：将低糖无血清DMEM培养基置于37℃ 低氧密闭培养箱中，以2 L/min的流速通入95%N2和5%CO2混合气体，持续通入4 h充分饱和培养基，用上述培养基快速置换培养至对数生长期的H9c2高糖培养基，细胞于低氧培养箱中继续培养3 h，然后将培养液更换为10%FBS的高糖培养液，于37℃、5% CO2恒温密闭培养箱中培养4 h复氧。

实验分组：对照组：37℃、5% CO2、95%空气恒温密闭培养箱中培养；H/R组：按照模型建立的方法进行培养，缺氧3 h后复氧4 h；实验组：转染48 h后进行H/R模型建立。

1.4细胞转染 用培养液稀释对数生长期的H9c2细胞，以每孔2×105个细胞接种于6孔板中，细胞融合为一层时进行转染，用无血清OptiMEM培养液稀释Lipofectamine2000和各组载体后取脂质体与等体积载体轻柔混匀，室温孵育15 min，将混合液滴入培养好的细胞中，混合均匀，培养6 h后换成完全培养液，转染48 h，进行后续实验。

1.5Real-time PCR检测RNA表达 收集转染48 h的各组H9c2细胞，用试剂盒提取总RNA。按照反转录合成cDNA，测定浓度和纯度后置于-80℃保存。取cDNA按照 real-time PCR说明书进行反应，miR-24-3p上游引物为5′-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′，下游引物为5′-ACCGAGUCAAGUCGUCCUUGUC-3′；PDCD5 上 游 引 物 为5′-CCATGGCGGACGAGGAGCTTG-3′，下 游 引 物 为5′-TCAATAATCGTCATCTTCATC-3′；反应程序为：95℃ 4 min，95℃ 30 s、60℃ 40 s、72℃ 45 s，35个循环，72℃ 10 min。运用IQ5TM real-time PCR 检测系统(Bio-Rad)进行数据分析。

1.6流式细胞术测定细胞凋亡率 收集处理好的各组H9c2细胞，接种于6孔板中(2×105个细胞/孔)，培养24 h，离心收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，稀释细胞浓度为1×106个/ml，根据凋亡试剂盒说明书进行操作，取100 μl标记缓冲液重悬细胞，然后加入5 μl膜联蛋白(Annexin)V-FITC和10 μl碘化丙啶(PI)，室温避光20 min，流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.7双荧光素酶报告系统实验 将转染后的H9c2细胞进行收集，Trypsin消化细胞后稀释，以2×104个细胞/孔接种于24孔板中，置于37℃ 5% CO2培养箱中培养24 h，若细胞融合为一层时进行转染，构建PDCD5的野生型(WT-PDCD5)和突变型(MUT-PDCD5)双荧光素酶报告载体，分别共转染miR-NC或miR-24-3p。转染48 h后，收集细胞室温裂解20 min，离心收集上清，加入荧光素酶底物，检测上清中荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参照，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.8Western印迹检测PDCD5和凋亡相关蛋白 收集培养好的H9c2细胞，加入裂解液孵育20 min，冰浴超声破碎细胞，收集蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，转膜，室温封闭2 h，加入一抗(抗PDCD5抗体 1∶1 000，抗Bcl-2抗体1∶500，抗Bax抗体1∶1 000，抗Cleaved-caspase-3抗体1∶1 000)，4℃孵育过夜，PBST洗膜2次，加入稀释的二抗(PDCD5二抗1∶1 500，Bcl-2二抗1∶100，Bax二抗1∶1 000，Cleaved-caspase-3二抗1∶1 000)室温孵育2 h，分析蛋白水平，以GAPDH为内参照。

1.9统计学处理 采用SPSS21.0统计软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1H/R处理对心肌细胞中miR-24-3p和PDCD5表达的影响 与对照组相比，H/R组心肌细胞中miR-24-3p表达量显著下降(P<0.05)，PDCD5 mRNA和蛋白表达量显著上升(P<0.05)，见图1，表1。

图1 PDCD5蛋白表达

表1 H/R处理对心肌细胞中miR-24-3p和PDCD5表达的影响

2.2miR-24-3p过表达对心肌细胞中LDH、SOD活性和MDA含量的影响 qRT-PCR结果发现，与对照组相比，H/R组miR-24-3p表达量显著下降(P<0.05)，与H/R+miR-NC组相比，H/R+miR-24-3p组miR-24-3p表达量显著上升(P<0.05)。细胞损伤测定结果显示，与对照组相比，H/R组细胞中LDH和MDA含量显著升高(P<0.05)，SOD活性显著降低(P<0.05)；与H/R+miR-NC组相比，H/R+miR-24-3p组LDH和MDA含量显著降低(P<0.05)，SOD活性显著升高(P<0.05)，见表2。

2.3miR-24-3p过表达可抑制心肌细胞凋亡 与对照组相比，H/R组凋亡相关蛋白Bcl-2表达量显著下降(P<0.05)，Bax和Cleaved-caspase-3表达量显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著上升(P<0.05)；与H/R+miR-NC组相比，H/R+miR-24-3p组凋亡相关蛋白Bcl-2表达量显著升高(P<0.05)，Bax和Cleaved-caspase-3表达量显著下降(P<0.05)，细胞凋亡率显著下降(P<0.05)，见图2，表3，图3。

表2 miR-24-3p过表达对心肌细胞中LDH、SOD活性和MDA含量的影响

图2 miR-24-3p过表达对心肌细胞凋亡的影响

表3 miR-24-3p过表达对心肌细胞凋亡的影响

图3 各组凋亡相关蛋白表达

2.4抑制PDCD5表达对心肌细胞损伤的影响 与对照组相比，H/R组PDCD5蛋白表达量显著升高(P<0.05)，凋亡相关蛋白Bcl-2表达量显著下降(P<0.05)，Bax表达量显著上升(P<0.05)，细胞凋亡率显著上升(P<0.05)，细胞中LDH和MDA含量显著增多(P<0.05)，SOD活性显著降低(P<0.05)；与H/R+si-NC组相比，H/R+si-PDCD5组PDCD5蛋白表达量显著下降(P<0.05)，凋亡相关蛋白Bcl-2表达量显著升高(P<0.05)，Bax表达量显著下降(P<0.05)，细胞凋亡率显著下降(P<0.05)，细胞中LDH和MDA含量显著减少(P<0.05)，SOD活性显著升高(P<0.05)。见图4，表4。

2.5miR-24-3p靶向调控PDCD5的表达 Targetscan软件预测结果显示，PDCD5的3′UTR序列中含有与miR-24-3p互补的核苷酸序列，见图5。双荧光素酶报告系统所示，与miR-NC组(1.03±0.08、0.98±0.07)相比，miR-24-3p组WT-PDCD5萤火虫荧光素酶相对活性(0.42±0.03)显著下降(t=17.488，P=0.000)；而MUT-PDCD5萤火虫荧光素酶相对活性(1.04±0.09)没有明显变化(t=1.289，P=0.226)。Western印迹结果发现，与miR-NC组(0.49±0.05)相比，miR-24-3p组PDCD5表达量(0.18±0.03)显著下降(P<0.05)；与anti-miR-NC组(0.50±0.05)相比，anti-miR-24-3p组的PDCD5表达量(0.88±0.08)显著上升(P<0.05)。见图6。

表4 抑制PDCD5表达对心肌细胞损伤的影响

图5 PDCD5的3′UTR中含有与miR-24-3p互补的核苷酸序列

图6 Western印迹检测PDCD5蛋白表达

2.6PDCD5过表达逆转了上调miR-24-3p对心肌细胞损伤的作用 与H/R+miR-NC组相比，H/R+miR-24-3p组PDCD5蛋白表达量显著下降(P<0.05)，细胞中LDH和MDA含量显著减少(P<0.05)，SOD活性显著上升(P<0.05)，凋亡相关蛋白Bcl-2表达量显著上升(P<0.05)，Bax表达量显著下降(P<0.05)，细胞凋亡率显著下降(P<0.05)；与H/R+miR-24-3p+pcDNA组相比，H/R+miR-24-3p+pcDNA-PDCD5组PDCD5蛋白表达量显著上升(P<0.05)，细胞中LDH和MDA含量显著增多(P<0.05)，SOD活性显著下降(P<0.05)，凋亡相关蛋白Bcl-2表达量显著下降(P<0.05)，Bax表达量显著上升(P<0.05)，细胞凋亡率显著上升(P<0.05)。见图7，表5。

图7 PDCD5和凋亡相关蛋白表达

表5 PDCD5过表达逆转了上调miR-24-3p对心肌细胞损伤的作用

3 讨 论

社会老年化的加剧和工作压力的增大，AMI发病率越来越高，且呈年轻化趋势，预计2030年AMI患者将接近2 300万〔8〕。治疗过程中产生的MIRI损伤可导致永久性残疾或死亡，如何减轻AMI幸存者的MIRI损伤是临床主要问题，目前尚无具体的靶向治疗策略，研究MIRI的治疗方式是这一领域研究的热点〔9〕。

miRNA如miR-1、miR-21、 miR-29、miR-92a、miR-101、 miR-499等通过调控心肌细胞、心肌成纤维细胞、内皮细胞等的增殖和凋亡，参与心脏发育、心肌重塑、心律失常和心力衰竭等生物过程〔10，11〕。研究发现，miR-24 参与心肌细胞的凋亡作用，益气逐瘀方通过上调大鼠缺血心肌组织中的miR-24表达，减轻心肌梗死大鼠的心肌损伤和心肌细胞凋亡〔12〕。温明华〔13〕研究发现，远端缺血预适应诱导的外泌体能够通过传递miR-24至细胞中下调促凋亡蛋白Bim表达，从而减轻氧化应激处理后H9c2细胞的凋亡。Xiao等〔14〕发现，miR-24-3p在缺血/再灌注(I/R)的心肌细胞中表达下调，过表达miR-24-3p可通过激活Nrf2-Keap1途径保护心肌细胞免受I/R损伤诱导的体外心肌细胞凋亡。Tan等〔15〕发现，在心肌I/R损伤小鼠模型中，miR-24-3p下调，miR-24-3p可通过抑制RIPK1，从而在心肌I/R损伤中发挥心脏保护作用。本研究也证实，miR-24-3p在H/R处理后的心肌细胞H9c2细胞中表达显著下降，与Xiao等〔14〕和Tan等〔15〕研究结果一致，过表达miR-24-3p可减轻H/R对H9c2细胞的损伤，提高细胞抗氧化能力，抑制细胞凋亡，验证了miR-24-3p在H/R诱导的心肌损伤中发挥重要作用。

PDCD5原名TFAR19，最初是由我国学者从白血病细胞株TF-1中克隆得到，位于染色体19q12-q13.1，与P53、C-myc、Bcl-2和Bax等基因参与细胞凋亡的调控过程〔16，17〕。而任安立等〔18〕研究发现，H/R损伤的H9c2细胞中，PDCD5表达水平升高，沉默PDCD5可抑制核因子(NF)-κB信号通路，进而抑制H/R损伤诱导的心肌细胞凋亡和自噬。周凤华等〔19〕研究表明，I/R模型组大鼠心肌中PDCD5表达量显著升高，中药定心方可抑制PDCD5表达，激活ERK通路，减轻心肌损伤。Zhang等〔20〕研究发现，在异丙肾上腺素诱导的小鼠中，过表达PDCD5可诱导自噬和抑制凋亡进而改善心脏功能和抑制由异丙肾上腺素诱导的心脏重塑。本研究与任安立等〔18〕和周凤华等〔19〕研究结果一致；抑制PDCD5表达可减轻H/R对H9c2细胞的损伤，提高细胞抗氧化能力，抑制细胞凋亡，验证了PDCD5在MIRI损伤中的作用。

此外，通过Targetscan软件预测结果发现，PDCD5的3′UTR中含有与miR-24-3p互补的核苷酸序列，预示miR-24-3p与PDCD5可能存在结合位点或某种调控关系。双荧光素酶报告系统结果也显示，miR-24-3p靶向负调控PDCD5的表达，过表达PDCD5可逆转上调miR-24-3p对H/R诱导的H9c2细胞损伤的作用，即miR-24-3p通过下调PDCD5表达减轻H/R诱导的心肌细胞H9c2损伤，抑制细胞凋亡，验证了两者在心肌细胞中存在调控关系。

本研究首次发现，在H/R处理的大鼠心肌细胞H9c2中，miR-24-3p通过靶向抑制PDCD5表达进而减轻H/R诱导的心肌细胞H9c2损伤，抑制心肌细胞凋亡。另外，上调miR-24-3p可能通过抑制RIPK1和PDCD5，激活Nrf2-Keap1和ERK通路，抑制NF-κB信号通路，达到减轻H/R诱导的心肌细胞H9c2损伤，抑制心肌细胞凋亡的作用。

综上，miR-24-3p有望成为心肌细胞MIRI损伤分子治疗的新靶点，对患者MIRI损伤治疗和提高患者生存质量具有重要指导意义。