敲减SATB1抑制结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭

陈超 冯长松 张伟丽 李先维

(信阳职业技术学院 1医学院，河南 信阳 464000；2附属医院内科)

结肠癌是常见的恶性肿瘤，肿瘤细胞恶性表型与肿瘤细胞中相关基因的异常表达有关，研究肿瘤细胞恶性表型分子机制对于研究肿瘤发生机制和肿瘤的治疗具有重要意义〔1〕。核基质结合区结合蛋白质(SATB)1在T细胞、前B细胞及神经和骨髓组织中表达水平较高，而在正常组织中的表达水平较低〔2〕。近年来的研究发现，SATB1与肿瘤的发生有关，其在乳腺癌、肺癌等肿瘤中异常高表达，并且在肿瘤的转移中发挥促进作用〔3,4〕。在甲状腺癌中发现敲低SATB1具有抑制肿瘤细胞侵袭的作用〔5〕。目前有研究已经发现SATB1在结肠癌中阳性表达率明显高于癌旁组织，SATB1可能参与结肠癌细胞恶性增殖和转移过程〔6〕。本实验探讨敲减SATB1对结肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等恶性生物学特性的影响。

1 材料与方法

1.1材料 结肠癌SW480细胞购自南京科佰生物科技有限公司；阴性对照慢病毒和SATB1 shRNA重组慢病毒由南京双领生物科技有限公司构建；Revert Aid第一链cDNA Synthesis试剂盒、Power SYBR Green PCR Master Mix购自美国Thermo；钙黏附蛋白E(E-cadherin)抗体、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-9抗体、波形蛋白(Vimentin)抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；基质金属蛋白酶(MMP)-9抗体、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3抗体、MMP-2抗体购自美国Cell Signaling Technology；SATB1抗体购自美国Abcam。

1.2慢病毒感染和分组 SW480细胞分成3组，分别为：SW480-WT组、SW480-sh-NC组、SW480-sh-SATB1组，SW480-WT组为不感染慢病毒的野生型SW480细胞，SW480-sh-NC组、SW480-sh-SATB1组分别为感染阴性对照慢病毒和SATB1 shRNA重组慢病毒的SW480细胞。SW480细胞接种到6孔细胞培养板中，在倒置显微镜下观察细胞密度为40%可以用于慢病毒感染，常规方法感染慢病毒，步骤为：把孔内的液体吸弃以后，添加MOI=20的慢病毒液，继续放置在37℃，5% CO2培养箱中培养12 h以后，取出细胞培养板，更换细胞培养液，继续培养3 d以后，用嘌呤霉素筛选稳定感染的细胞株用于后续实验。

1.3Realtime PCR测定敲减效果 取融合率超过80%的SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1细胞，用Trizol试剂提取细胞中的总RNA，吸取2 μl的RNA用紫外风光光度计检测A260/A280的比值，其比值1.8～2.0可以用于实验。根据Revert Aid第一链cDNA Synthesis试剂盒说明书逆转录合成cDNA，获取的cDNA进行下一步的PCR扩增。引物设计如下：GAPDH正义链：5′-TGACTTCAACAGCGACACCA-3′,反义链5′-CACCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′,SATB1正义链：5′-CAGCACACCACCCAGCCGTC-3′,反义链：5′-GCTCGCACAACCATCCCTGGC-3′,引物交由上海生工合成。Power SYBR Green PCR Master Mix进行定量PCR，反应程序为：95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，30 s；共35个循环。采用2-△△Ct法计算SATB1 mRNA水平。

1.4Western印迹测定敲减效果 取生长至80%的SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤以后，添加蛋白裂解溶液，放在冰上裂解液30 min，期间每隔10 min混合一次。4℃，12 000 r/min离心10 min后，吸取蛋白上清溶液，添加到5×上样缓冲液混合后，放在100℃煮沸5 min。按照常规方法配制5%的浓缩胶和10%的分离胶，按照每个上样孔中添加50 μg蛋白样品上样后，设置100 V电压电泳，溴酚蓝刚跑出凝胶以后停止电泳。在100 V电压条件下把蛋白转移到NC膜上，放在封闭液(以TBST配制5%牛血清白蛋白)中在室温中孵育2 h后，将NC膜放在一抗和二抗反应液中，抗体反应液均以封闭液稀释，一抗按照1∶800稀释，二抗按照1∶2 000稀释。电化学发光(ECL)以后，暗室中曝光，扫描图片，用Image J分析条带灰度值，设置GAPDH为参照。

1.5噻唑蓝(MTT)方法测定结肠癌细胞增殖 SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1细胞接种到96孔细胞培养板中，每个孔中添加100 μl的细胞悬浮液，放在37℃，5%CO2培养箱中培养48 h以后，于每个孔内添加20 μl的MTT溶液，放在培养箱内继续培养4 h。取出培养板，把孔内液体倒掉，添加DMSO溶液150 μl，置于酶标仪上测定490 nm的吸光度(A)值，以SW480-WT细胞存活率为100%，分析SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1细胞存活率。

1.6平板克隆实验测定结肠癌细胞克隆能力 SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1细胞按照每孔300个细胞接种到6孔板内，十字形晃动使细胞均匀分布，培养14 d以后，用甲醇固定，放在空气中干燥，添加吉姆萨染色后，观察细胞克隆形成数目，以克隆形成数目占接种细胞数目的百分比表示细胞克隆形成率。

1.7流式细胞术测定结肠癌细胞凋亡变化 取SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1细胞各106个，用预冷的PBS将细胞洗涤3次以后，添加300 μl的结合缓冲液混合后，分别加入碘化丙啶(PI)和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)染液混，上流式细胞仪检测前添加200 μl的结合缓冲液。

1.8MTT方法测定结肠癌细胞黏附能力 将50 μg/ml的纤维黏连蛋白添加到96孔板中，每孔75 μl，用37℃预热后的PBS洗涤以后，用牛血清白蛋白将非特异性位点封闭。将SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1细胞接种到上述96孔板中，继续培养2 h以后，用PBS把没有黏附的细胞洗掉，添加100 μl的细胞液和20 μl的MTT溶液，孵育4 h后，吸除上清，继续加入150 μl的DMSO溶液，置于酶标仪上测定490 nm的A值。以SW480-WT细胞黏附率为100%，分析SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1细胞黏附率变化。

1.9细胞划痕实验测定结肠癌细胞迁徙运动能力 SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1细胞按照每孔中添加5×104个细胞接种到6孔板内，细胞至长满时，用移液枪枪头在培养板的中央划出一条细痕，添加PBS洗涤以后，以不含血清的培养液继续培养细胞，培养48 h后，取出培养板，用Image pro plus分析划痕的宽度。划痕愈合率=100%×(划痕初始宽度-48 h划痕宽度)÷划痕初始宽度。

1.10Transwell小室测定结肠癌细胞迁移和侵袭能力 细胞侵袭和迁移实验均用Transwell小室检测，侵袭实验前用50 mg/L的基质胶将小室湿化后进行实验。步骤为：将 SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1细胞以不含血清的培养液悬浮以后，细胞密度为1×105个/ml，各组细胞吸取200 μl添加到Transwell小室的上室中，在下室中添加500 μl的含有胎牛血清的细胞培养液，培养48 h以后，取出小室，用结晶紫染色以后，随机选取5个视野，计数细胞穿膜数量。

1.11Western印迹检测上皮间质转化(EMT)标志蛋白E-cadherin、Vimentin和侵袭迁移蛋白MMP-2、MMP-9及凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表达变化 取SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1细胞，用Western印迹方法测定细胞中E-cadherin(抗体以1∶600稀释)、Vimentin(抗体以1∶800稀释)、MMP-2(抗体以1∶1 000稀释)、MMP-9(抗体以1∶1 000稀释)、Cleaved Caspase-3(抗体以1∶400稀释)、Cleaved Caspase-9(抗体以1∶400稀释)蛋白表达水平。

1.12统计分析 采用SPSS21.0软件进行方差分析，LSD-t检验。

2 结 果

2.1SATB1 shRNA下调结肠癌细胞中SATB1表达 与SW480-sh-NC组比较，SW480-sh-SATB1组细胞中SATB1 mRNA和蛋白表达水平均明显降低(均P<0.05)，见图1，表1。

2.2敲减SATB1抑制结肠癌细胞增殖和克隆 与SW480-sh-NC组比较，SW480-sh-SATB1组细胞存活率和克隆形成率均降低(P<0.05)，见图2，表2。

图1 Western 印迹检测SATB1 shRNA重组慢病毒感染后SW480细胞中SATB1蛋白表达变

表1 SATB1 shRNA重组慢病毒感染后SW480细胞中SATB1 mRNA和蛋白表达水平

图2 平板克隆实验检测SATB1 shRNA重组慢病毒感染后SW480细胞克隆形成能力

表2 SATB1 shRNA重组慢病毒感染后SW480细胞存活率和克隆形成率

2.3敲减SATB1诱导结肠癌细胞凋亡和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达 与SW480-sh-NC组比较，SW480-sh-SATB1组细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达水平均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3，图4，表3。

图3 流式细胞术检测敲减SATB1后SW480细胞凋亡变化

2.4敲减SATB1抑制结肠癌细胞迁徙运动和黏附 与SW480-sh-NC组比较，SW480-sh-SATB1组细胞划痕愈合率和细胞黏附率均显著降低(P<0.05)，见表4。

图4 Western 印迹检测敲减SATB1后SW480细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达变化

表3 SATB1 shRNA重组慢病毒感染后SW480细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平

2.5敲减SATB1抑制结肠癌细胞侵袭和迁移 与SW480-sh-NC组比较，SW480-sh-SATB1组细胞侵袭数目、迁移数目和MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)，见图5，表5。

表4 SATB1 shRNA重组慢病毒感染后SW480细胞划痕愈合率和细胞黏附率

图5 Western 印迹检测SATB1 shRNA重组慢病毒感染后SW480细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达变化

表5 SATB1 shRNA重组慢病毒感染后SW480细胞侵袭数目、迁移数目和MMP-2、MMP-9蛋白表达水平

2.6敲减SATB1抑制结肠癌细胞EMT 与SW480-sh-NC组比较，SW480-sh-SATB1组细胞E-cadherin蛋白表达水平显著升高，Vimentin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，见图6，表6。

图6 Western 印迹检测SATB1 shRNA重组慢病毒感染后SW480细胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表达变化

表6 SATB1 shRNA重组慢病毒感染后SW480细胞E-cadherin和Vimentin蛋白表达水平

3 讨 论

本实验结果说明敲减SATB1能够抑制结肠癌体外生长和转移潜能的作用，SATB1可能在结肠癌发生和转移中发挥促进作用，SATB1可能是一种癌基因。

SATB1能够特异性识别核基质结合区域的作用，参与细胞内染色体高级结构的修饰过程，对于多个基因的转录过程具有调控作用，在细胞分化、凋亡、增殖等过程中具有重要作用〔7〕。近几年来的研究报道显示，SATB1与肿瘤的发生和转移有关，其在肿瘤患者中高表达与预后、分期、浸润具有相关性〔8〕。在乳腺癌中的研究报道显示，SATB1通过调控下游基因的表达参与肿瘤血管形成、细胞黏附、增殖等过程〔9〕。还有报道表明，SATB1在肺癌细胞系中表达水平异常升高，并证实了SATB1是一个与肺癌转移相关的调控因子，其可以通过激活下游信号增强肺癌转移和恶性增殖能力〔3,10〕。在结肠癌中的研究表明，SATB1高表达与结直肠癌患者预后有关，SATB1在结肠癌转移中发挥关键作用，SATB1具有抑制结直肠癌细胞生长、迁移的作用，并且SATB1在结直肠癌患者肿瘤组织的核和胞质中的活性高于未改变的结直肠癌患者黏膜，SATB1调控机制尚不清楚〔11～13〕。本实验在体外结肠癌细胞中证实了SATB1在体外结肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移、黏附、运动等生物学作用中的调控作用，更为全面的说明了SATB1在结肠癌恶性发生过程中与在其他肿瘤中作用相同，均可能发挥促进作用。

肿瘤细胞的恶性生物学特性与细胞内的多种调控因子有关，细胞凋亡受到细胞内凋亡相关蛋白如Caspase的调控作用。目前已知Caspase-3是凋亡反应的下游因子，其被活化后形成Cleaved Caspase-3是细胞凋亡不可逆的标志，Caspase-9是凋亡反应的起始因子，其活化后形成Cleaved Caspase-9可以诱导Caspase凋亡反应发生〔14〕。在膀胱癌中发现SATB1基因沉默可以促进Caspase-3活化诱导细胞凋亡发生〔15〕。本实验证实了下调SATB1具有诱导结肠癌细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达的作用，说明下调SATB1可能通过激活Caspase凋亡反应诱导细胞凋亡发生。

肿瘤的转移是威胁肿瘤患者生命健康的重要原因，肿瘤细胞侵袭和迁移过程与细胞中MMP有关，MMP-2、MMP-9是两个与肿瘤侵袭能力正相关的MMP成员，其可以将细胞外基质降解，促进肿瘤向远端转移〔16,17〕。在前列腺癌中已经证实SATB1表达水平与MMP-2呈正相关，下调SATB1抑制促卵泡素诱导的卵巢癌细胞侵袭过程的同时下调MMP-2表达〔18,19〕。肿瘤转移的早期标志是肿瘤细胞EMT，EMT是广泛存在于人体组织中的生理过程，其与胚胎发育、器官生长等有关〔20〕。EMT发生时细胞上皮标志物E-cadherin表达水平下降，而间质标志物Vimentin表达升高，E-cadherin和Vimentin表达变化是细胞EMT的标志〔21〕。本实验在结肠癌中证实了下调SATB1可以降低细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达，抑制Vimentin表达并促进E-cadherin表达，说明下调SATB1可以抑制结肠癌细胞EMT和基质金属蛋白酶合成，这与其在肿瘤转移中的研究报道相符合。

总之，下调SATB1具有抗结肠癌细胞转移潜能的作用，其作用机制与抗Caspase凋亡反应及MMP表达有关，SATB1在结肠癌转移和发展中可能发挥促进作用，靶向SATB1可能是治疗结肠癌的有效途径。目前对于SATB1的研究机制发现，SATB1是Wnt/β-catenin信号传导的新靶点，SATB1高表达与β-连环蛋白异常表达，SATB1和β-连环蛋白与TCF7L2的启动子和Wnt信号的下游靶点结合并调节它们的表达〔22,23〕。本实验对于SATB1调控结肠癌转移机制尚未研究，以后实验中会探讨SATB1与β-catenin信号转导在结直肠癌中的调控机制。