miR-486-5p靶向TRPM2对帕金森病模型细胞自噬和凋亡的影响

彭秀华 柳明杰

(1锦州市中心医院神经内科，辽宁 锦州 121000；2锦州医科大学)

帕金森病(PD)是临床常见神经退行性疾病，常发生于老年人群，其主要病理特征为基底神经节中脑黑质致密部多巴胺能神经元的退化及进行性缺失，调查研究显示PD发病率逐年增加，严重影响患者生活质量〔1〕。既往研究显示线粒体功能障碍、炎症、氧化应激、细胞凋亡与PD发生发展密切相关〔2〕。微小RNA(miRNA)可通过调控靶基因表达而参与人类多种疾病发生发展过程，研究表明miRNA在PD患者异常表达并可调控神经元细胞凋亡、自噬及分化等过程〔3〕。目前PD发病机制尚未完全阐明，因而探究PD发病机制及寻找治疗靶点具有重要意义。研究表明miR-486-5p在缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤中下调表达，miR-486-5p过表达对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤具有保护作用〔4〕。研究表明miR-486-5p在脂多糖(LPS)诱导的髓核细胞中表达水平降低，miR-486-5p过表达可抑制炎症因子的表达〔5〕。但miR-486-5p在PD模型细胞中的表达及其对PD模型细胞自噬、凋亡的影响尚未可知。Targetscan预测显示瞬时受体电位(TRP)M2可能是miR-486-5p的靶基因，研究表明PD患者与1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞中TRPM2的表达水平升高，并可促进MPP+诱导的神经细胞凋亡〔6〕。相关报道指出下调TRPM2的表达可保护缺血性大鼠脑损伤〔7〕。但miR-486-5p是否通过靶向调控TRPM2的表达影响PD模型细胞自噬、凋亡尚未可知。本研究主要探讨PD细胞模型中miR-486-5p的表达水平变化，分析其对PD细胞模型自噬及凋亡的影响，初步探究miR-486-5p对TRPM2的调控作用，为揭示PD发病机制提供新方向。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 MPP+购自北京谨明生物科技有限公司；人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞购自美国ATCC细胞库。RPMI1640培养基购自上海浩然生物技术有限公司；胰蛋白酶与胎牛血清购自上海玉博生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液购自美国Sigma公司；Trizol与Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒与荧光定量PCR试剂盒均购自北京天根生化科技公司；膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司；miR-486-5p模拟物(mimics)及阴性对照 mimic NC 序列(miR-NC)、TRPM2小干扰RNA(si-TRPM2)及乱序无意义阴性序列(si-NC)购自广州锐博生物科技有限公司；兔抗人微管相关蛋白轻链(LC)3Ⅱ、LC3Ⅰ抗体购自美国CST公司；兔抗人线粒体融合蛋白(Mfn)2多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗人核呼吸因子(NRF)1多克隆抗体购自武汉菲恩生物科技有限公司；兔抗人TRPM2抗体购自武汉艾美捷科技有限公司；兔抗人B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved-caspase)3抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自美国BIOWORLD公司；双荧光素酶报告基因载体购自南京中洪博元生物科技有限公司；荧光素酶活性检测试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1构建PD模型 SK-N-SH细胞置于RPMI1640培养液中培养，待细胞生长融合度达到80%～90%时，用100 μmol/L的MPP+诱导SK-N-SH细胞24 h，建立PD细胞模型〔8〕。

1.2.2实验处理及分组 实验设置Con组(未经MPP+诱导的SK-N-SH细胞)、MPP+组(100 μmol/L的MPP+诱导SK-N-SH细胞24 h)，检测两组SK-N-SH细胞中miR-486-5p、TRPM2的表达水平。为探究miR-486-5p表达变化对MPP+诱导的SK-N-SH细胞自噬及凋亡的影响，实验设置MPP++miR-NC组(miR-NC转染至SK-N-SH细胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培养液处理细胞24 h)、MPP++miR-486-5p组(miR-486-5p mimics转染至SK-N-SH细胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培养液处理细胞24 h)。为探究TRPM2表达变化对MPP+诱导的SK-N-SH细胞自噬及凋亡的影响，实验设置MPP++si-NC组(si-NC转染至SK-N-SH细胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培养液处理细胞24 h)、MPP++si-TRPM2组(si-TRPM2转染至SK-N-SH细胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培养液处理细胞24 h)。为探究miR-486-5p是否调控TRPM2的表达，实验设置miR-NC组(miR-NC转染至SK-N-SH细胞48 h)、miR-486-5p组(miR-486-5p mimics转染至SK-N-SH细胞48 h)、anti-miR-NC组(anti-miR-NC转染至SK-N-SH细胞48 h)、anti-miR-486-5p组(anti-miR-486-5p转染至SK-N-SH细胞48 h)，采用Western印迹法检测各组细胞中TRPM2蛋白表达。后续实验设置MPP++miR-486-5p+pcDNA组(miR-486-5p mimics与pcDNA共转染至SK-N-SH细胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培养液处理细胞24 h)、MPP++miR-486-5p+pcDNA-TRPM2组(miR-486-5p mimics与pcDNA-TRPM2共转染至SK-N-SH细胞48 h，用含有100 μmol/L MPP+的培养液处理细胞24 h)，细胞转染时严格按照Lipofectamine2000试剂说明书进行操作。

1.2.3实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中miR-486-5p、TRPM2 mRNA表达水平 采用Trizol法提取SK-N-SH细胞总RNA，利用Nanodrop2000c超微量分光光度计测定RNA浓度，按照逆转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，miR-486-5p正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物为：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；U6正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物为：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；TRPM2正向引物为5′-AAGTACGTCCGAGTCTCCCA-3′，反向引物为：5′-CGGAAAATGCTCTTCAGCCG-3′；GAPDH正向引物为5′-CTGAAGAGCTGCTTCACCAA-3′，反向引物为：5′-ATGGTGCTGTCCTTGACAAC-3′，引物均由上海生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，ROX Reference Dye(50×)0.4 μl，ddH2O 6 μl；反应条件：95 ℃预变性2 min循环1次，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循环40次。置于ABI 7500实时荧光定量PCR仪检测，采用2-ΔΔCt法计算miR-486-5p、TRPM2 mRNA的相对表达量。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组SK-N-SH细胞，0.25%胰酶消化，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞3次，每次5 min，加入500 μl结合缓冲液悬浮细胞，室温条件下加入5 μl Annexin V-FITC与5 μl PI，充分混匀，于1 h内置于流式细胞仪检测并计算细胞凋亡率。

1.2.5荧光素酶报告基因检测miR-486-5p的靶基因 TargetScan预测显示TRPM2的3′UTR区存在miR-486-5p的持续性结合位点，利用基因突变技术将集合位点进行突变，分别将结合位点与突变位点分别载入荧光素酶报告基因载体构建野生型载体WT-TRPM2与突变型载体MUT-TRPM2，取对数生长期SK-N-SH细胞，实验设置4组：WT-TRPM2+miR-NC共转染组、WT-TRPM2+miR-486-5p mimics共转染组、MUT-TRPM2+miR-NC共转染组、MUT-TRPM2+miR-486-5p mimics共转染组，各组细胞转染48 h，收集细胞，参照荧光素酶活性检测试剂盒测定各组相对荧光素酶活性。

1.2.6Western印迹检测Mfn2、NRF1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3、TRPM2蛋白表达 收集各组SK-N-SH细胞，预冷PBS洗涤细胞3次，每次5 min，加入RIPA裂解液裂解完全，收集上清液(细胞总蛋白)，采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜，室温条件下用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃摇床内孵育24 h，室温条件下加入二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h，滴加增强型化学发光试剂(ECL)显影，定影，应用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值。

1.3统计学处理 应用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-486-5p和TRPM2在MPP+诱导SK-N-SH细胞损伤中的表达 与Con组相比，MPP+组SK-N-SH细胞中miR-486-5p的表达水平显著降低(P<0.05)，TRPM2 mRNA及蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)，见图1、表1。

图1 TRPM2蛋白表达

表1 miR-486-5p和TRPM2在MPP+诱导SK-N-SH细胞损伤中的表达

2.2miR-486-5p过表达对MPP+诱导SK-N-SH细胞中线粒体相关蛋白和自噬相关蛋白表达的影响 MPP++miR-486-5p组SK-N-SH细胞中miR-486-5p的表达水平显著高于MPP++miR-NC组(P<0.05)，提示成功上调MPP+诱导SK-N-SH细胞中miR-486-5p的表达。Western印迹检测结果显示，与Con组相比，MPP+组SK-N-SH细胞中Mfn2、NRF1蛋白表达量均显著降低(P<0.05)，LC3Ⅱ蛋白表达量显著升高(P<0.05)，而LC3Ⅰ蛋白表达量无明显变化；相较于MPP++miR-NC组，MPP++miR-486-5p组SK-N-SH细胞中Mfn2、NRF1蛋白表达量均显著升高(P<0.05)，LC3Ⅱ蛋白表达量显著降低(P<0.05)，而LC3Ⅰ蛋白表达量无明显变化，见图2、表2。

1～4：Con组、MPP+组、MMP++miR-NC组、MPP++miR-486-5p组；图3同

表2 miR-486-5p过表达对MPP+诱导SK-N-SH细胞中线粒体相关蛋白和自噬相关蛋白表达的影响

2.3miR-486-5p过表达对MPP+诱导SK-N-SH细胞凋亡的影响 与Con组比较，MPP+组SK-N-SH细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，Bax、cleaved-caspase3蛋白表达量均显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)；相对于MPP++miR-NC组，MPP++miR-486-5p组SK-N-SH细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，Bax、cleaved-caspase3蛋白表达量均显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达量显著升高(P<0.05)，见表3、图3、图4。

表3 miR-486-5p过表达对MPP+诱导SK-N-SH细胞凋亡的影响

2.4干扰TRPM2表达对MPP+诱导SK-N-SH细胞中线粒体相关蛋白和自噬相关蛋白表达的影响 MPP++si-TRPM2组SK-N-SH细胞中TRPM2蛋白表达量较MPP++si-NC组显著降低(P<0.05)，提示成功降低MPP+诱导SK-N-SH细胞中TRPM2的高表达。相较于MPP++si-NC组，MPP++si-TRPM2组SK-N-SH细胞中Mfn2、NRF1蛋白表达量显著升高(P<0.05)，LC3Ⅱ蛋白表达量显著降低(P<0.05)，LC3Ⅰ蛋白表达量变化无统计学意义，见表4、图5。

图3 Western印迹检测Bcl-2、Bax、cleaved-caspese3蛋白表达

图4 miR-486-5p过表达对MPP+诱导SK-N-SH细胞凋亡的影响

表4 干扰TRPM2表达对MPP+诱导SK-N-SH细胞中线粒体相关蛋白和自噬相关蛋白表达的影响

1～4:Con组、MPP+组、MPP++si-NC组、MPP++si-TRPM2组；图6同

2.5干扰TRPM2表达对MPP+诱导SK-N-SH细胞凋亡的影响 与MPP++si-NC组相比，MPP++si-TRPM2组SK-N-SH细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，Bax、cleaved-caspase3蛋白表达量显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达量显著升高(P<0.05)，见图6、表5。

图6 TRPM2和凋亡相关蛋白表达

2.6miR-486-5p靶向调控TRPM2的表达 Targetscan预测显示TRPM2的3′UTR中含有与miR-486-5p互补的核苷酸序列，见图7。双荧光素酶报告实验结果显示，与WT-TRPM2 miR-NC组相比，(WT-TRPM2)miR-486-5p组荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；与MUT-TRPM2 miR-NC组相比，(MUT-TRPM2)miR-486-5p组荧光素酶活性变化无统计学意义，见表6。Western印迹检测结果显示，与miR-NC组(0.41±0.04)比较，miR-486-5p组SK-N-SH细胞中TRPM2蛋白表达量显著降低(0.22±0.02，P<0.05)；与anti-miR-NC组(0.39±0.04)比较，anti-miR-486-5p组SK-N-SH细胞中TRPM2蛋白表达量显著升高(0.85±0.08，P<0.05)，见图8。表明miR-486-5p可靶向调控TRPM2的表达。

2.7TRPM2过表达逆转了miR-486-5p过表达对MPP+诱导SK-N-SH细胞中线粒体相关蛋白、自噬相关蛋白的表达和细胞凋亡的作用 相对于MPP++miR-486-5p+pcDNA组，MPP++miR-486-5p+pcDNA-TRPM2组SK-N-SH细胞中Mfn2、NRF1蛋白表达量显著降低(P<0.05)，LC3Ⅱ蛋白表达量显著升高(P<0.05)，LC3Ⅰ蛋白表达量变化无统计学意义，SK-N-SH细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，Bax、cleaved-caspase3蛋白表达量显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)，见图9、表7。

表5 干扰TRPM2表达对MPP+诱导SK-N-SH细胞凋亡的影响

图7 TRPM2的3′UTR中含有与miR-486-5p互补的核苷酸序列

表6 双荧光素酶报告实验

1～4：miR-NC组、miR-486-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-486-5p组

1～4：MPP+ miR-NC组、MPP+ miR-486-5p组、MPP+ miR-486-5p+pcDNA组、MPP+ miR-486-5p+pcDNA-TRPM2组

表7 TRPM2过表达逆转了miR-486-5p过表达对MPP+诱导SK-N-SH细胞中线粒体相关蛋白、自噬相关蛋白的表达和细胞凋亡的作用

3 讨 论

miRNA在PD患者脑组织中异常表达，并可在神经系统疾病发生过程中发挥重要调控作用，研究表明神经元细胞凋亡、自噬与PD发生发展密切相关，miRNA可通过调控神经元细胞凋亡与自噬从而参与PD发生发展过程〔9，10〕。既往研究报道显示用MPP+诱导SK-N-SH细胞建立PD模型〔11〕。本研究通过MPP+诱导SK-N-SH细胞建立PD细胞模型，探寻新型miRNA的表达变化及其在PD发展进程中的作用机制。

miR-486-5p在膝骨关节炎患者中呈低表达，其表达量与膝骨关节炎严重程度密切相关〔12〕。相关报道指出miR-486-5p通过靶向Smad2抑制TGF-β2诱导的晶状体上皮细胞增殖、侵袭〔13〕。但miR-486-5p在PD发展过程中的作用机制尚未可知。本研究结果显示，MPP+诱导SK-N-SH细胞中miR-486-5p的表达水平显著降低，提示miR-486-5p表达下调可能参与PD发生过程。NRF1作为转录因子，可参与线粒体生物合成及呼吸链的电子传递过程，抑制NRF1表达可促进氧化应激反应的发生进而促进细胞凋亡，Mfn2是一种线粒体融合基因，研究报道指出Mfn2过表达可保护线粒体免受损伤从而保护神经元细胞〔14，15〕。本研究结果显示MPP+诱导SK-N-SH细胞中Mfn2、NRF1蛋白表达量显著下降，而miR-486-5p过表达可明显提高Mfn2、NRF1蛋白表达量，提示miR-486-5p过表达可降低MPP+诱导的SK-N-SH细胞自噬水平。研究表明LC3属于自噬相关蛋白，其中LC3Ⅱ是LC3Ⅰ的裂解形式，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高表示自噬活跃，检测LC3Ⅱ水平可反映自噬的强弱〔16〕。本研究结果显示MPP+诱导的SK-N-SH细胞中LC3Ⅱ蛋白表达量显著升高，说明MPP+可提高SK-N-SH细胞自噬活性，进一步研究发现miR-486-5p过表达可明显降低LC3Ⅱ蛋白表达量，提示miR-486-5p过表达对PD细胞模型的自噬活性具有明显的抑制作用。本研究通过流式细胞术发现，MPP+诱导的SK-N-SH细胞凋亡率显著升高，但miR-486-5p过表达可明显降低MPP+造成的高凋亡率，提示miR-486-5p过表达对PD细胞模型的凋亡具有明显的抑制作用。研究报道指出Bcl-2蛋白属于抗凋亡蛋白，Bax属于促凋亡蛋白，细胞接收凋亡信号时，Bax可促使线粒体凋亡因子释放激活caspase3形成cleaved-caspase3进而促进细胞凋亡〔17〕。本研究进一步检测发现MPP+诱导的SK-N-SH细胞中Bcl-2蛋白表达降低，Bax、cleaved-caspase3蛋白表达升高，说明SK-N-SH细胞发生自噬的同时出现细胞凋亡，但miR-486-5p过表达后SK-N-SH细胞中Bcl-2蛋白表达升高，Bax、cleaved-caspase3蛋白表达降低，提示miR-486-5p过表达可通过上调Bcl-2的表达及下调Bax、cleaved-caspase3的表达从而抑制MPP+诱导的SK-N-SH细胞凋亡。但线粒体自噬与凋亡在PD发生过程中的相关性及其可能的作用机制仍需进一步研究。

TRPM2属于细胞膜上的非选择性阳离子通道，研究表明TRPM2在脑组织中呈高表达，并可调控氧化应激、炎症反应进而参与多种中枢神经系统疾病的发生发展过程〔18〕。研究报道指出丁基苯酚可能通过下调TRPM2的表达，抑制神经细胞损伤从而对慢性缺血性脑组织神经发挥保护作用〔19〕。本研究结果显示MPP+诱导SK-N-SH细胞中TRPM2的表达水平显著升高，干扰TRPM2的表达可抑制SK-N-SH细胞凋亡，提高Mfn2、NRF1的表达水平，降低LC3Ⅱ的表达水平，提示干扰TRPM2的表达可降低MPP+诱导的SK-N-SH细胞自噬活性。进一步研究显示干扰TRPM2的表达可降低SK-N-SH细胞凋亡率，抑制Bax、cleaved-caspase3的表达，促进Bcl-2的表达，提示干扰TRPM2的表达可通过调控细胞凋亡相关蛋白表达而抑制PD模型细胞的凋亡。本研究通过双荧光素酶报告实验与Western印迹实验证实miR-486-5p可靶向调控TRPM2的表达，进一步实验结果显示TRPM2过表达可逆转了miR-486-5p过表达对MPP+诱导的SK-N-SH细胞线粒体相关蛋白、自噬相关蛋白的表达及细胞凋亡的作用。提示miR-486-5p过表达可通过下调靶基因TRPM2的表达从而抑制MPP+诱导的SK-N-SH细胞凋亡及自噬。

综上所述，miR-486-5p在PD细胞模型中表达下调，而TRPM2表达上调，miR-486-5p过表达可通过抑制TRPM2的表达而抑制细胞凋亡及自噬从而保护神经细胞，可为PD的基因治疗提供新方向。但本研究仅在体外验证miR-486-5p过表达与PD模型细胞自噬、凋亡的关系，关于其在体内是否具有相同的作用机制仍需进一步研究。