YAP抑制剂对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖、凋亡的影响

卢洪飞 张敏鸿 杨建琼 罗耀玲

(赣南医学院第一附属医院 1检验科，江西 赣州 341000；2临床医学研究中心)

慢性粒细胞白血病(CML)是一种由费城染色体阳性的造血干细胞克隆扩增导致的骨髓增生性肿瘤，CML的发病机制与融合基因BCR-ABL1的表达有关，融合基因BCR-ABL1编码是具有酪氨酸激酶(TK)活性的BCR-ABL蛋白，促进白血病细胞加重骨髓增生和抗凋亡〔1〕。由于白细胞增殖凋亡失衡、细胞分化失调，导致大量不成熟白细胞在骨髓内聚集，抑制骨髓的正常造血。目前，TK抑制剂(TKIs)作为CML治疗的临床一线用药，显著提高了患者生存率，但仍存在部分患者对TKIs耐药或不耐受〔2〕。因此，寻找新的靶标基因是目前CML治疗领域亟需解决的问题之一。

细胞的生长凋亡受细胞信号通路调控网络的精密调节，肿瘤的发生及进展与多种信号通路异常失活密切相关。CML的发生及进展中Wnt、Notch、Hedgehog、Hippo信号通路等多条信号通路失调〔3,4〕。Hippo信号通路是一个协调正常细胞增殖、死亡和分化，调控组织生长的高度保守的生长控制信号通路，其失调与肿瘤的发生密切相关〔5〕，YAP是Hippo信号通路关键的转录调节因子，在多种肿瘤中异常表达。本研究拟分析YAP抑制剂维替泊芬通过抑制Hippo信号通路对CML细胞系K562细胞增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1主要实验仪器 CO2培养箱(Thermo、Forma 311)、洁净工作台(SW-CJ-2FD，上海博迅)、生物显微镜(Olympus，BX 41)、蛋白质电泳转印系统(Bio-Rad，Mini-PROTEAN Tetra)、流式细胞仪(BD，FACSCalibur)、颗粒制冰机(三洋，SIM-F140)、低速冷冻离心机(中佳，KDC-2046)、连续光谱多功能酶标仪(Thermo Fisher，Varioskan Flash)、超纯水仪(Millipore，RiOs5+Milli-Q Biocel)、万向脱色摇床(北京六一，WD-9405B)等。

1.2主要实验材料与试剂 K562细胞系(由赣南医学第一附属医院临床医学研究中心保藏提供)；RPMI1640培养基及胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；噻唑蓝(MTT)粉剂(美国Sigma公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；Bax、Bcl2一抗(美国Abcam公司)；Western印迹相关试剂、β-actin一抗(上海碧云天公司)；维替泊芬(Selleck)等，所有化学试剂为分析纯。

1.3细胞培养 取液氮贮存的K562细胞，37℃快速融化进行复苏，含10% FBS的RPMI-1640培养基置于5%CO237℃培养箱中培养，显微镜下观察细胞状态，细胞生长至对数期时，1 000 r/min离心5 min离心传代，进行后续实验。

1.4MTT比色法测细胞增殖抑制率 取对数生长期细胞，细胞计数，调节细胞至合适浓度，接种4×103个细胞于96孔板；分为调零组、空白对照组、药物处理组，各孔均重复3次，维替泊芬工作浓度依次为1、2、4、8、16 μmol/L，96孔中最终工作体积200 μl，二甲基亚砜(DMSO)含量不高于0.1%；细胞置于5%CO2、37℃培养箱中培养，分别于24、48、72 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，继续培养4 h；1 000 r/min离心5 min，吸弃上清，每孔加入150 μl DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解；酶标仪测量各孔OD 570 nm的吸光值。实验重复3次，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)×100%，根据GraphPad Prism6.0软件计算维替泊芬作用K562细胞24 h半数抑制浓度(IC50)值，选择合适浓度范围用于后续实验。

1.5AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞检测法 1 000 r/min离心5 min收集4、8、16 μmol/L维替泊芬作用24 h后细胞；预冷磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，1 000 r/min离心5 min洗涤；加入300 μl 1倍结合缓冲液悬浮细胞；加入5 μl Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15 min；加入5 μl PI染色后1 h内完成流式细胞仪上机检测。Annexin V-FITC阳性细胞群为凋亡细胞，计算其占细胞总数比例，即为细胞凋亡率。重复3次实验，统计分析。

1.6Western印迹 1 000 r/min离心5 min收集4、8、16 μmol/L维替泊芬处理24 h后的细胞，裂解细胞，提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)定量总蛋白浓度；12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，每泳道上样蛋白量为50 μg，80 V恒压2 h；200 mA恒流湿转1 h至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；室温5%脱脂牛奶封闭30 min；4℃摇床孵育稀释合适浓度的一抗过夜；TBST洗膜3次，每次10 min；4℃摇床孵育稀释合适浓度的对应二抗4 h；TBST洗膜3次，每次10 min；电化学发光(ECL)显影，手动曝光，扫描胶片，Image J软件分析目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值比值，计算相对表达量。实验重复3次，统计分析。

1.7统计方法 使用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1MTT细胞增殖实验结果 1、2、4、8、16 μmol/L维替泊芬浓度作用K562细胞24、48、72 h后，细胞增殖抑制率呈剂量及时间依赖性(P<0.05)，处理24 h时，IC50值为11.80 μmol/L，选择4、8、16 μmol/L进行后续实验，见表1。

2.2流式细胞检测细胞凋亡结果 4、8、16 μmol/L维替泊芬作用K562细胞24 h后，单因素方差分析显示组间比较差异显著(F=59.09，P<0.05)。细胞凋亡率呈剂量依赖分别为(8.86±0.99)%、(16.54±0.45)%、(27.08±4.41)%，与对照组(3.49±0.61)%比较，K562细胞凋亡率在8、16 μmol/L维替泊芬作用24 h后差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

表1 不同浓度维替泊芬不同时间作用K562细胞的增殖抑制率

图1 维替泊芬促进K562细胞凋亡

2.3Western印迹检测细胞凋亡相关蛋白实验结果 4、8、16 μmol/L维替泊芬作用K562细胞24 h后，促凋亡相关蛋白Bax表达随维替泊芬浓度增加而升高，分别为对照组的1.14±0.08、1.28±0.06、1.74±0.11倍，单因素方差分析显示组间比较差异有统计学意义(F=50.56，P<0.05)，8、16 μmol/L时与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；抑制凋亡相关蛋白Bcl-2表达随维替泊芬浓度升高而降低，分别为对照组的0.75±0.09、0.54±0.07、0.36±0.08倍，单因素方差分析显示组间比较差异显著(F=47.11，P<0.05)，4、8、16 μmol/L时与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 维替泊芬对K562细胞凋亡相关蛋白的表达影响

3 讨 论

维替泊芬是一种用作光动力疗法的光敏剂药物，于2000年被FDA批准用于治疗年龄相关的黄斑变性〔6〕。研究表明，维替泊芬能够抑制YAP-TEAD相互作用，抑制Hippo信号通路活性，抑制YAP诱导的肝脏过度生长〔7〕。Hippo信号通路是一条进化高度保守的信号通路，在哺乳动物中对调节组织内稳态、器官大小和肿瘤发生至关重要〔5〕。Hippo信号通路失调与多种肿瘤的发生发展密切相关，参与调节肿瘤细胞的生物学行为，如促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，细胞分化失调等，从而促进肿瘤发生发展〔8〕。YAP是Hippo信号通路的主要效应器之一，主要通过与TEAD家族转录因子相互作用发挥转录协同激活作用，促进下游靶基因的表达。研究表明，YAP在多种人类肿瘤中过度表达，并增加其核定位，包括结肠癌〔9〕、肺癌〔10〕、卵巢癌〔11〕、肝癌〔12〕、胃癌〔13〕等，表明YAP作为致癌基因，与多种肿瘤发生发展、侵袭迁移及不良预后相关。因此，特异性抑制YAP-TEAD相互作用，抑制YAP核蓄积，为抗癌治疗提供新的分子靶点。

CML是一种造血干细胞克隆扩增导致的骨髓增生性肿瘤，目前，临床主要采用TKIs靶向TK治疗CML，但晚期CML、对TKIs耐药、不敏感这部分患者仍然是治疗CML急需解决的困难之一。近年国内外研究表明，Hippo信号通路异常激活与包括CML在内的白血病的发生发展有密切关系〔4,14,15〕，但Hippo信号通路在CML发生发展中的作用机制及YAP抑制剂维替泊芬对CML细胞生物学功能的作用文献报道较少。本研究结果显示维替泊芬作用K562可抑制其增殖，且呈时间及剂量依赖性，表明Hippo信号通路在K562细胞增殖中发挥重要作用，特异性抑制Hippo信号通路可抑制CML细胞K562增殖；流式检测结果显示维替泊芬作用K562促进细胞凋亡，且凋亡率随浓度的增加而升高，Western印迹结果显示维替泊芬作用K562细胞后，凋亡相关蛋白Bax表达上调，Bcl-2表达下调，其机制可能为维替泊芬抑制Hippo信号通路活性后，使得Bcl-2表达抑制，促进Bax表达，从而促进细胞凋亡，具体机制有待进一步研究。本研究表明，维替泊芬作用K562细胞，可抑制细胞增殖，促进凋亡，细胞增殖抑制可能与凋亡促进有关。

总之，Hippo信号通路在包括CML在内的多种恶性克隆性血液系统疾病中异常激活，与白血病的发生、发展及预后密切相关。在CML中Hippo信号通路异常激活，通过Hippo信号通路YAP抑制剂维替泊芬靶向抑制Hippo信号通路活性，可以抑制细胞增殖、凋亡，或许可为CML靶向治疗补充思路。维替泊芬可特异性抑制YAP-TEAD相互作用，抑制Hippo信号通路，其或许可成为CML治疗的一种老药新用化疗药物。