西黄丸对大鼠乳腺癌癌前病变的阻断作用及对NF-κB蛋白表达的影响

李德辉 苏伊璠 范焕芳 孙春霞 韩长辉 马盼 闫娇娇 吕素君

(河北中医学院附属医院 河北省中医院，河北 石家庄 050011)

乳腺癌发病率和死亡率居全球女性恶性肿瘤之首，严重威胁女性身体健康和生命安全〔1〕。现代研究证实，乳腺癌的发生经历“正常细胞→单纯性增生→非典型增生→原位癌→浸润性癌”的连续病变过程，癌前病变是乳腺癌发生发展的必经阶段，而在该阶段采取积极的干预措施可以阻断甚至逆转癌变进程〔2〕。干预乳腺癌癌前病变，阻断其向乳腺癌发展，是目前防治乳腺癌的研究关键。乳腺癌癌前病变属于中医“乳癖”范畴，痰毒瘀结是其发生发展的核心病机。经典名方西黄丸具有清热解毒、化痰散结、活血化瘀、消肿止痛之功效，经临床实践用于治疗乳腺癌癌前病变、防治乳腺癌疗效显著〔3〕。本课题组前期研究发现〔4〕，西黄丸浸提液可抑制乳腺癌癌前病变细胞活力、诱导细胞凋亡，其作用机制可能与其抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路mTOR与血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达相关。本研究以7,12-二甲基苯并蒽(DMBA)协同雌孕激素序贯方法复制SD大鼠乳腺癌癌前病变模型，观察西黄丸对模型大鼠乳腺癌癌前病变的阻断作用及对核转录因子(NF)-κB蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1动物 6周龄SPF级健康未育SD雌性大鼠60只，体重(180±20)g，由河北省实验动物中心提供，动物合格证号：1705351，自由进食、饮水，常规饲养1 w后进行实验。

1.2药物及试剂 苯甲酸雌二醇注射液，宁波第二激素厂生产；黄体酮注射液，宁波第二激素厂生产；枸橼酸他莫昔芬片，扬子江药业集团有限公司，批号：17041311；DMBA，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(TCI)，CAS57-97-6；西黄丸，浙江天一堂药业有限公司，批号：1703011；NF-κB鼠单克隆抗体，美国Abcam公司。DMBA配制：精密称取DMBA，按7 mg/ml比例溶于芝麻油，置于60℃水浴箱，超声振荡溶解备用。西黄丸水溶液制备：根据实验需要，实验前一天将西黄丸浸泡于少许蒸馏水中，以恰能浸泡药物颗粒为准，实验当日将浸泡软的西黄丸碾碎，用蒸馏水配制成浓度分别为27 mg/ml、55 mg/ml、137 mg/ml的西黄丸水溶液备用。他莫昔芬水溶液配制：根据实验需要用蒸馏水配制成0.4 mg/ml的他莫昔芬水溶液。

1.3仪器 ASP200S全自动组织脱水机，德国徕卡公司；EG11508组织包埋机，德国徕卡公司；RM2255全自动轮转切片机，德国徕卡公司；LEICA DMRA2照像显微镜，德国徕卡公司；Leica Qwin 图像分析系统，德国徕卡公司。

1.4动物模型复制〔5〕实验第1天用溶解有DMBA的芝麻油，按1 ml/100 g比例给大鼠一次性灌胃。第2天起，按照5 d为1个周期〔第1～3天，大鼠后腿内侧注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/(kg·d)；第4天，大鼠后腿内侧注射黄体酮4 mg/(kg·d)；第5天观察〕，连续12个周期，建立乳腺癌癌前病变大鼠模型。

1.5分组及给药方法 按体重分层随机分组法将60只大鼠分为正常对照组10只、疾病模型组50只。给药方法分别如下：正常对照组：一次性灌胃不含DMBA的芝麻油1 ml/100 g，常规饲养；疾病模型组：按1.4造模方法复制模型，常规饲养。10 w造模成功后，将疾病模型组造模成功大鼠按照体重分层随机分组法分为疾病模型组，他莫昔芬组，西黄丸低、中、高剂量组共5组，每组10只，给药方法如下：疾病模型组：常规饲养；他莫昔芬组：给予他莫昔芬水溶剂(4 mg/kg)1 ml/100 g灌胃，每天1次，连续28 d，常规饲养。西黄丸低、中、高剂量组：分别给予西黄丸水溶剂低(270 mg/kg)、中(550 mg/kg)、高剂量(1 370 mg/kg)1 ml/100 g灌胃，每天1次，连续28 d，常规饲养。

1.6标本采集 于动物实验过程的第14周末为取材时间点。取材前各组大鼠禁食不禁水24 h，以10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉后。无菌条件下取大鼠胸腹部6对乳腺及其周围皮肤、皮下组织约1.0 cm×1.0 cm。中性甲醛固定，用于苏木素-伊红(HE)染色、免疫组化检测。

1.7大鼠乳腺组织形态学观察 取各组大鼠6对部分乳房，用10%甲醛固定，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋切片(厚4 μm)。常规HE染色，参照文献在光镜下进行组织学观察其增生程度〔6〕。

1.8大鼠乳腺组织NF-κB蛋白表达的检测 取各组大鼠第2对部分乳房，用10%甲醛固定，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋切片(厚4 μm)。用免疫组化法检测大鼠乳腺组织NF-κB蛋白的表达，按免疫组织化学SP法操作技术常规进行，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染。以已知NF-κB阳性切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。NF-κB阳性表达的判断标准：NF-κB阳性染色定位于细胞质中，呈棕黄色颗粒，偶见于胞核呈棕黄色。使用Leica Qwin图像分析系统对NF-κB蛋白表达的阳性面积和平均光密度进行定量分析。

1.9统计学方法 使用SPSS20.0统计软件进行单因素方差分析、秩和检验。

2 结 果

2.1西黄丸可阻断、逆转乳腺癌前病变大鼠乳腺组织病理形态学变化 各组大鼠乳腺组织增生程度不同(χ2=358.58，P=0.000)，其中疾病模型组增生程度最重，与正常对照组比较，疾病模型组增生程度差异有统计学意义(Z=14.529，P=0.000)；与疾病模型组比较，他莫昔芬组、西黄丸各剂量组增生程度显著较低(P<0.05，P<0.01)。见表1，图1。

表1 西黄丸对乳腺癌前病变大鼠模型乳腺组织病理程度的影响(n=10，n)

图1 各组乳腺组织病理形态学变化(HE，×100)

2.2西黄丸可下调乳腺癌癌前病变大鼠乳腺组织NF-κB蛋白的表达水平 与正常对照组比较，疾病模型组NF-κB蛋白表达明显增加(P<0.01)。与疾病模型组比较，他莫昔芬组与西黄丸各剂量组可显著降低NF-κB蛋白表达水平(P<0.01，P<0.05)。见图2、表2。

图2 各组乳腺组织NF-κB蛋白表达(免疫组化，×200)

表2 西黄丸对乳腺癌癌前病变大鼠模型乳腺组织NF-κB蛋白表达的影响

3 讨 论

乳腺癌变的发病机制至今尚未完全明晰，近年出现的多种关于该病发病机制的理论学说，如雌激素及其受体介导学说，孕激素受体介导学说，细胞增殖凋亡失衡理论，癌基因、抑癌基因表达异常学说，血管生成相关因子理论等，虽然观点不一，但都认为乳腺癌变的发生是多种因素共同作用的结果。乳腺癌癌前病变动物模型是研究乳腺癌癌前病变病因、发病机制、评价治疗效果的重要实验工具，目前乳腺癌癌前病变动物造模方法一般通过自发性、移植型、诱发型3种途径〔7〕。DMBA联合雌孕激素序贯建立的乳腺癌癌前病变模型是目前得到普遍认可的动物模型之一，DMBA对乳腺组织具有极高的选择性和特异性(70%～80%)〔8〕，外源性或内源性雌孕激素是导致乳腺癌变重要因素，DMBA与雌孕激素联合应用能够明显提高乳腺癌癌前病变的发生率〔9〕。本项目采用DMBA联合雌孕激素序贯成功建立SD大鼠乳腺癌癌前病变模型，阳性对照药他莫昔芬的给药剂量通过参照文献和预实验确定〔10〕，西黄丸剂量参照陈奇〔11〕主编的《中药药理研究方法学》进行人与大鼠剂量折算而来。研究结果表明正常对照组大鼠乳腺组织全部为正常腺体，与正常对照组比较，疾病模型组在第10周时可见同一大鼠的多个乳腺出现不同程度的导管上皮增生和非典型增生，第14周见到较多的Ⅲ级非典型增生及少数导管内癌发生，此模型经过乳腺导管上皮细胞“正常→单纯性增生→非典型增生→原位癌→浸润性癌”的动态发展过程，与人乳腺癌病变组织病理形态学特点非常类似。与疾病模型组比较，他莫昔芬组大鼠乳腺组织增生程度降低，说明他莫昔芬可有效阻断此模型大鼠乳腺癌前病变的发生发展，故此模型是本项目研究的较理想模型。与疾病模型组比较，西黄丸各剂量组大鼠乳腺组织增生程度降低，说明西黄丸可减轻DMBA联合雌孕激素序贯诱导的乳腺癌癌前病变大鼠乳腺组织病理形态学变化。

现代药理研究表明〔3,12〕，西黄丸可通过抑制雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)表达，逆转P53基因突变，抑制癌基因Bc1-2的过表达，提高外周血白介素(IL)-2、干扰素(IFN)-γ水平及CD3+、CD4+、免疫共刺激分子B7-1含量，增强免疫清除功能，逆转乳腺癌癌前病变非典型增生的病理变化，阻断乳腺癌的发生发展，但未见其关于调控NF-κB分子方面的报道。在肿瘤细胞中，NF-κB具有抗凋亡、促进肿瘤细胞存活的功能。很多研究认为〔13,14〕，在乳腺癌的发生、发展中NF-κB的活化起决定性作用，NF-κB蛋白在乳腺癌中的过表达与组织学分级有关，随着乳腺癌的发生发展，NF-κB蛋白水平在病变乳腺中的表达呈动态增高，说明在乳腺癌变中NF-κB异常活化，一定程度上促进了乳腺癌的发生发展。本研究表明NF-κB在模型大鼠乳腺癌癌前病变组织中异常活化过表达，西黄丸可下调乳腺癌癌前病变模型大鼠乳腺组织NF-κB蛋白的表达。

综上所述，西黄丸可减轻DMBA联合雌孕激素序贯诱导的乳腺癌癌前病变大鼠乳腺组织病理形态学变化，其机制可能与其下调乳腺组织中NF-κB蛋白的表达相关。本研究结果进一步拓宽了西黄丸治疗乳腺癌癌前病变，预防乳腺癌的作用机制，为下一步进行西黄丸通过抑制NF-κB信号通路阻断乳腺癌发生、发展、转移的研究提供了基础。