当归四逆汤有效成分最佳组合抑制氧化应激干预心肌再灌注损伤

刘会会 贺少辉 刘美林 尹佳 强明敏 高宇勤

(1西安市第九医院，陕西 西安 710054；2暨南大学医学院)

缺血再灌注损伤是心肌缺血再灌注后出现的一种病理现象，与过度氧化应激有关，过度的氧化应激可导致丙二醛(MDA)蓄积，而过多MDA可造成组织损伤、基因突变、细胞膜结构破坏，最终导致心肌梗死面积增加〔1,2〕。超氧化物歧化酶(SOD)可减轻氧化应激从而降低MDA，进而减少心肌再灌注损伤引起的心肌梗死面积〔3,4〕。本课题组前期研究表明当归四逆汤主要成分芍药苷、阿魏酸、肉桂酸、甘草酸等4种有效成分对心肌再灌注损伤有保护作用〔5〕，但这4种成分是否在心肌缺血再灌注损伤氧化应激中起干预作用，以及这4种药物如何组合可发挥其最佳药效，目前尚无研究。故本实验目的主要探讨这4种成分对心肌缺血再灌注损伤氧化应激的干预作用及最佳药物组合。目前正交实验是针对多因素水平的重要研究方法，其优点是“均匀分散，齐整可比”，可以用少量的样本探究多因素水平的变化，是分析因式设计的主要方法，通过此种实验设计可以找出多因素不同作用，节省样本量。本实验利用在体大鼠冠状动脉前降支(LAD)结扎术模型，采用正交实验设计方法，探讨当归四逆汤有效成分通过干预氧化应激减轻大鼠在体心肌缺血再灌注损伤，并力求找到最佳鸡尾酒组合。为拓展当归四逆汤临床应用范围提供初步的基础试验研究。

1 材料及方法

1.1试剂与仪器 芍药苷、阿魏酸、甘草酸及肉桂酸购于南京泽朗医药科技有限公司(批号分别为ZL20090409SYG、ZL20090425AWS、ZL20090301GCS、ZL2008009RGS)，SOD测定试剂盒、MDA测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，BCA蛋白含量测定试剂盒购于凯基生物有限公司。

1.2动物模型的建立 SPF 级雄性SD(128只)大鼠，体重280～400 g，由广东省医学实验动物中心提供。许可证号：SCXK(粤)2008-0002，将大鼠称重、麻醉、固定、备皮消毒、分离皮下组织及肌肉、显露气管、气管插管，接呼吸机，调整呼吸频率60次/min、通气量20 ml/kg。纵行剪开第三胸骨左缘胸部皮肤约4 cm，钝性分离，显露胸膜，撑开肋骨，撕破心包，显露心脏，确定缝扎位置(肺动脉圆锥与左心耳交界处下方2 mm，前降支LAD近端位置)。叠1个0.8～1.0 mm的凹槽硅胶管，用0号线，出针打结结 扎LAD，缺血30 min，松开结扎,复灌2 h。模型复制 的可靠性以心电图(ECG)Ⅱ导联ST段抬高为心肌 缺血存在，以ST段回落1/2为再灌注成功。本实验 建模总共有12只SD大鼠因为麻醉和手术原因亡，死亡率为9.3%〔5〕。

1.3分组及给药方案 实验选用L16(44)正交实验表，每味药为1种因子，其代号随机选定，分别编为A甘草酸、B阿魏酸、C芍药苷、D肉桂酸4种因子，取不用药、低剂量、中剂量、高剂量4种水平，分别设为1为不用药，2为低剂量组，3为中剂量组，4为高剂量组4种水平，甘草酸：灌胃剂量分别为25 mg/kg(低剂量)、50 mg/kg(中剂量)、100 mg/kg(高剂量)；芍药苷：灌胃剂量分别为25 mg/kg(低剂量)、50 mg/kg(中剂量)、100 mg/kg(高剂量)；肉桂酸：灌胃剂量分别为100 mg/kg(低剂量)、200 mg/kg(中剂量)、400 mg/kg(高剂量)；阿魏酸：灌胃剂量分别为200 mg/kg(低剂量)、300 mg/kg(中剂量)、400 mg/kg(高剂量)；以上剂量都是全天剂量，1次/d，灌胃4 d，最后一次于手术前30 min给予。见表1。

表1 正交实验L16(44)设计表(n=8)

1.4检测心肌中SOD、MDA

1.4.1检测心肌SOD 实验终点时暴露心脏，原位结扎左冠状动脉主干，经主动脉逆行灌注(压力为80 mmHg)0.5% Evan蓝2～3 ml，立即取心脏，以预冷生理盐水冲洗残余液，将左心室与其他心肌组织分离，快速置于液氮中，取出冷冻心脏，沿左心室长轴方向连续环切，每片2～3 mm，正常心肌组织为蓝色，缺血区心肌组织为粉色，然后将无蓝染缺血心肌置入1% TTC磷酸缓冲液(pH 7.4)中37℃孵育20 min，此时坏死区呈灰白色，非坏死区呈深红色，其后将坏死区和非坏死区分离。然后取左心室广泛灰白缺血区0.2 g，滤纸吸干，加裂解液溶解，取上清液离心，过滤除去试管中上层脂肪组织，保留上清液。样品准备完毕后用BCA蛋白浓度测定试剂盒计算出样品中总SOD含量，最后根据SOD试剂盒计算出单位细胞内SOD含量。

1.4.2检测心肌MDA 取0.2 g左心室广泛灰白区按照上述步骤制备成上清液。然后按照BCA蛋白含量测定试剂盒计算出样品中总MDA含量。最后用MDA试剂盒计算出单位细胞内MDA含量。

2 结 果

2.1心肌 SOD 测定结果 本实验通过对SOD活力的正交实验直观表(表2)分析，比较各因素的极差发现阿魏酸、甘草酸、芍药苷、肉桂酸对于大鼠心肌缺血再灌注损伤模型SOD活力影响的顺序是甘草酸>阿魏酸>芍药苷>肉桂酸，通过方差分析(正交设计16组进行方差分析，以α<0.05 为有统计学意义)发现甘草酸有统计学意义(见表3)。根据心肌组织SOD活力实验数据越大越有利，方差分析发现甘草酸有统计学意义，故阿魏酸、甘草酸、芍药苷、肉桂酸四药混合干预大鼠心肌缺血再灌注损伤的心肌组织SOD的活力最佳选择方案是芍药苷0 mg/kg、甘草酸50 mg/kg、阿魏酸0 mg/kg、肉桂酸0 mg/kg。

表2 四种药物干预大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌SOD、MDA正交实验L16(44)直观分析

表3 正交实验16组心肌SOD方差分析结果

2.2心肌MDA测定结果 本实验通过对心肌MDA的正交实验直观表(表2)分析，比较各因素的极差发现阿魏酸、甘草酸、芍药苷、肉桂酸，大鼠心肌缺血再灌注损伤模型MDA影响的顺序是肉桂酸>阿魏酸>芍药苷>甘草酸，通过方差分析(正交设计 16 组进行方差分析，以α<0.05 为有统计学意义)发现阿魏酸及肉桂酸有统计学意义(见表4)。根据心肌组织MDA实验数据越小越有利，方差分析发现阿魏酸及肉桂酸有统计学意义，故阿魏酸、甘草酸、芍药苷、肉桂酸四药混合干预大鼠心肌缺血再灌注损伤的心肌组织MDA最佳选择方案是芍药苷0 mg/kg、甘草酸0 mg/kg、阿魏酸300 mg/kg、肉桂酸200 mg/kg。

表4 正交实验16组心肌MDA方差分析结果

3 讨 论

缺血再灌注损伤是缺血心肌恢复血流灌注过程中可诱导的损伤，其机制可能与氧化应激产生大量氧自由基相关，而大量氧自由基可激活脂质过氧化反应，不仅可以增加MDA含量还可损伤细胞膜结构，导致大量心肌细胞死亡〔6〕。SOD可清除氧自由基，从而降低MDA蓄积，进而减少心肌再灌注损伤引起的心肌梗死面积。本研究结果发现芍药苷对氧化应激引起的心肌再灌注损伤无明显干预作用。而阿魏酸、肉桂酸、甘草酸等提取物可明显升高SOD活性相应降低氧化应激及MDA含量，进而减轻心肌再灌注损伤引起的心肌损伤且最佳鸡尾酒组合为：阿魏酸300 mg/kg、肉桂酸 200 mg/kg、甘草酸50 mg/kg(缩写为FCG)。此最佳组合可能是一种有效治疗心肌缺血再灌注损伤的鸡尾酒组合，为治疗心肌再灌注损伤提供了新的理论依据。