早期2型糖尿病肾病患者血糖波动与氧化应激、炎症及单核细胞自噬的相关性

周建华 李晓华 贝鹏剑 徐艳红 李丽华 朱祎

(上海中医药大学附属第七人民医院内分泌科，上海 200137)

血糖波动参与糖尿病肾病的发生发展，但机制尚不完全明了。氧化应激和炎症是糖尿病肾病发病的重要机制，而自噬在糖尿病肾病中的作用也受到越来越多的关注。血糖波动通过氧化应激引起糖尿病肾脏损伤，关于血糖波动与单核细胞自噬相关性的体内外研究均尚未见报道。本研究观察糖尿病肾病早期患者血糖波动与氧化应激、炎症因子及单核细胞自噬的相关性，旨在为糖尿病肾病的防治寻找新的靶点。

1 资料与方法

1.1资料 选取2016年11月至2018年11月上海中医药大学附属第七人民医院内分泌科就诊的早期2型糖尿病肾病患者120例。入选标准：①符合1999年世界卫生组织(WHO)2型糖尿病诊断标准。②3 mg/g≤2次尿白蛋白肌酐比(UACR)平均值<30 mg/g。③糖化血红蛋白(HbA1c)≤7%。④近3个月未改变降糖方案。⑤无低蛋白血症及贫血。⑥排除糖尿病急性并发症、严重大血管并发症(如心梗、脑梗)及其他可能影响糖代谢(如肺感染、心力衰竭、肾衰竭等)的疾病。⑦排除其他类型的非糖尿病肾病。⑧排除合并高血压患者。⑨排除近期使用影响糖代谢及抗氧化应激药物的患者。根据平均血糖波动幅度(MAGE)分成两组：A组：MAGE<3 mmol/L，B组：MAGE≥3 mmol/L。本研究经医院伦理委员会与批准，患者及家属知情并同意本研究。

1.2主要仪器与设备 贝克曼5800全自动生化分析仪：日本贝克曼公司，全自动酶免仪：西班牙Triturus，电泳仪：美国Bio-Rad公司，转膜仪：美国Bio-Rad公司，成像仪：美国Bio-Rad公司。

1.3主要试剂 人单核细胞趋化蛋白(MCP)-1酶联免疫吸附试验测定试剂盒：购自上海博舜公司，人肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验测定试剂盒：购自上海博舜公司，人白细胞介素(IL)-6酶联免疫吸附试验测定试剂盒：购自上海博舜公司，尿游离8-异前列腺素(8-isoPG)F2α酶联免疫吸附试验测定试剂盒购自美国Cayman公司，Anti-LC3B抗体：购自英国Abcam公司。

1.4观察指标 两组患者均测量身高、体重、腰围，计算体重指数(BMI)，予动态血糖监测(CGMS)72 h评估MAGE，外周血检测总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、空腹胰岛素(FINS)、HbA1c、MCP-1、TNF-α、IL-6、单核细胞LC3B-Ⅱ水平，留取晨尿监测UACR，24 h尿检测8-isoPGF2α。

1.5主要指标测定 血脂分析采用全自动生化分析仪，FINS测定采用电化学发光法，HbA1c测定采用离子交换高效液相色谱分析法，MCP-1、TNF-α、IL-6、8-isoPGF2α测定采用酶联免疫吸附试验，外周血单核细胞LC3B-Ⅱ水平测定采用Western印迹法。

1.6统计学分析 采用SPSS21.0软件进行正态性检验、方差齐性检验、t检验、秩和检验、χ2检验及多元线性逐步回归分析。

2 结 果

2.1基本资料 两组性别、HbA1c、FINS、年龄、TC、LDL-C、HDL-C、腰围对比差异无统计学意义(P>0.05)；与A组相比，B组UACR、MAGE、TG、BMI、8-isoPGF2α、MCP-1、IL-6、TNF-α显著更高(P<0.05)。见表1。

表1 两组基本资料比较

2.2多元线性逐步回归分析UACR影响因素 以UACR为因变量，年龄、MAGE、FINS、TC、LDL-C、TG、HDL-C、BMI、腰围、8-isoPGF2α、MCP-1、IL-6、TNF-α为自变量，仅MAGE、8-isoPGF2α、MCP-1进入最终方程，方程为：UACR=-6.336+7.824 MAGE+0.079 8-isoPGF2α+0.029 MCP-1，其中MAGE与UACR相关系数最大。

2.3两组外周血单核细胞自噬水平比较 与A组相比，B组LC3B-Ⅱ水平及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明显下降(P<0.05)。见图1、表2。

图1 两组LC3B Western印迹结果

表2 两组外周血单核自噬水平比较

3 讨 论

糖尿病肾病是2型糖尿病常见的微血管并发症，它的发生发展与血糖波动密切相关。研究发现〔1〕，在10项2型糖尿病患者的研究中，有9项报告显示血糖变异性与糖尿病微血管并发症发展或进展显著正相关。体外研究结果显示，与持续高葡萄糖处理组相比，间歇性高葡萄糖处理组通过上调骨桥蛋白的表达加剧大鼠系膜细胞增殖和胶原合成〔2〕。动物实验研究发现，与持续高血糖组相比，血糖波动组糖尿病大鼠肾小球肥大，毛细血管基底膜增厚，肾小囊腔扩大，基质增加，肾小管体积、肾肥大指数、肾小球硬化指数和Ⅳ型胶原含量均呈上升趋势〔3〕。MAGE目前被认为是评估日内血糖波动的金标准〔4〕。故本研究选用MAGE作为评价血糖波动的指标。本研究结果提示，血糖波动可能是血糖控制良好的早期2型糖尿病肾病患者的最重要影响因素。

氧化应激和炎症〔5〕是糖尿病肾病发病的重要机制。大多研究证实，血糖波动通过氧化应激和炎症引起糖尿病肾脏损伤。Chang等〔6〕研究表明血糖波动大的糖尿病患者处于高氧化应激及慢性炎症状态。体外研究发现，急性波动性高血糖加剧了内皮细胞的氧化应激及促炎症因子的表达〔7〕。动物实验研究发现，血糖波动增加了肾组织的氧化应激，抑制了蛋白激酶B(Akt)信号通路，加剧了肾组织超微结构的损害〔8〕。而增加的细胞内活性氧是炎症的直接激活剂〔9〕。血糖波动的减少可以直接降低患者体内的氧化应激水平〔10〕，HbA1c水平的波动减少，可降低糖尿病肾病的发生率〔11〕。而抗氧化及抗炎治疗治疗也可以改善糖尿病肾脏损伤〔5，12，13〕。8-isoPGF2α为自由基介导的花生四烯酸氧化形成的产物，是反映氧化应激的可靠指标〔14〕。MCP-1作为重要的炎症因子〔15〕，是已知最强的趋化因子，能够促进巨噬细胞中单核细胞的转化，并将巨噬细胞招募到炎症部位，并通过产生炎症细胞因子而导致局部和全身的炎症，对糖尿病肾病的发展和进展具有重要意义。TNF-α由单核巨噬细胞产生，可以直接诱导炎症发生，同时还可刺激炎症细胞产生更多的炎症介质，引起“瀑布式”炎症级联反应〔16〕。IL-6可由多种细胞产生，可延缓中性粒细胞的凋亡，使炎症反应持续存在〔17〕。因此，本研究选用8-isoPGF2α作为氧化应激指标，MCP-1、TNF-α及IL-6作为炎症指标。本研究结果显示，相较于血糖波动小组，血糖波动大组UACR与8-isoPGF2α及MCP-1、IL-6、TNF-β明显增高，UACR相关性分析显示，MAGE、8-isoPGF2α及MCP-1是UACR独立危险因素，即在早期2型糖尿病肾病患者中，血糖波动大组UACR水平及氧化应激水平、炎症因子水平均较血糖波动小组更高，且MAGE、氧化应激及MCP-1与UACR独立相关，与以往研究一致。同时，本研究还发现，相较于血糖波动小组，血糖波动大组TG及BMI更高，考虑可能与高BMI及高TG患者饮食管理相对较差、餐后血糖管理不佳致血糖波动较大有关，也可能与胰岛功能差异有关〔18〕。前期研究发现〔18〕，初诊2型糖尿病患者的晚相胰岛素分泌水平与BMI呈负相关，而晚相胰岛素分泌水平越低，血糖波动越大。然而，在相关性分析中，并未显示BMI及TG与UACR相关，因此，BMI及TG与血糖波动的相关性可能还需要更大样本量的临床研究来进一步探讨。

近年来，自噬在糖尿病肾病中作用受到越来越多的关注。LC3B-Ⅱ是公认的自噬标志物〔19〕。大多研究表明，自噬缺陷参与糖尿病肾病的发生发展〔20,21〕，激活自噬可能具有肾保护作用〔22,23〕。研究表明，单核巨噬细胞参与了糖尿病肾病早期的肾损伤〔24,25〕，它们通过产生炎症细胞因子而导致局部和全身的炎症〔16,17〕。Menne等〔26〕发现，MCP-1的抑制剂可降低糖尿病肾病患者的蛋白尿。本研究结果提示，与血糖波动小组比较，血糖波动大组外周血单核细胞LC3B-Ⅱ水平及LC3B-Ⅱ/LC3B-1比值均明显下降，即自噬活性减弱，并与尿ACR、MAGE、8-isoPGF2α及MCP-1呈负相关。一般来说，当肾细胞暴露在包括缺氧、基因毒性损伤、氧化应激和内质网应激等应激条件下时，自噬被激活，并对细胞存活起到关键作用〔27〕。然而，当细胞内压力仍未解决时，长时间自噬上调进入自噬缺陷〔28〕。在营养或能量过剩的状态下，自噬被下调。尽管这种下调在短期内是有益的，但有缺陷的自噬可能最终导致细胞损伤的累积，从而导致代谢性或年龄相关性肾脏疾病的发展〔29〕。Fiorentino等〔30〕在一项小样本的临床研究中发现，糖尿病肾病患者活检肾脏组织参与自噬的山羊组织金属蛋白酶抑制因子(TIMP)3、叉头框转录因子O亚族(foxo)1和foxo1靶基因显著减少，而foxo1转录抑制因子信号转导及转录激活因子(STAT)1表达显著增加，即肾组织自噬活性在一定程度上下降。动物实验研究中也发现〔31〕，高血糖状态下，足细胞的自噬活性随着自噬相关蛋白表达水平的降低而降低。急性高葡萄糖暴露可能通过活性氧激活自噬。在体外实验中发现，在暴露于高葡萄糖下的条件性永生化鼠足细胞(CIMPs)中，自噬在24 h内被诱导，同时产生活性氧，而抗氧化剂可抑制自噬〔32〕。活性氧介导的自噬作用在用饱和脂肪酸棕榈酸处理24 h的培养足细胞中得到进一步的观察〔33〕。这些结果提示足细胞对早期糖尿病的活性氧有积极的自噬作用。然而，高葡萄糖对足细胞自噬的影响似乎是时间依赖性的。Lenoir等〔34〕发现，24 h后高葡萄糖促进原代足细胞自噬通量，重组人自体吞噬相关蛋白(Atg)5缺失使足细胞对高葡萄糖诱导的细胞凋亡敏感，在稳定的足细胞系SVI细胞中，48 h后高葡萄糖诱导自噬，15 d后自噬被抑制。Tagawa等〔35〕进一步证实足细胞自噬功能不全在晚期糖尿病肾病中起关键作用。近年来，越来越多的证据支持自噬在炎症中的作用〔36,37〕。自噬缺陷能诱导核转录因子(NF)-κB介导的炎症〔38〕。自噬可以调节单核细胞的炎症反应。Alizadeh等〔39〕发现，在2型糖尿病患者中，雷帕霉素靶蛋白(mtor)信号通路的激活导致外周血单核细胞自噬减少，炎症因子表达增加。氧化应激可能介导了自噬缺陷促进的炎症发生。Liu等〔9〕发现，自噬阻滞导致受损的、产生活性氧的线粒体堆积，从而激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLRP)3炎症小体。NLRP3的炎症活性受自噬的负调节，而由非特征性细胞器产生的活性氧的正调节。基于以上血糖波动与氧化应激及炎症相关性及自噬与氧化应激及炎症的相关性，推测在早期的糖尿病肾病患者中，急性血糖波动引起氧化应激，激活单核细胞自噬，减少MCP-1释放，起到一定的肾脏保护作用，而持续的血糖波动引起的持续的氧化应激，最终仍导致单核细胞的自噬缺陷，MCP-1分泌增加，加之血糖波动及氧化应激本身刺激的MCP-1分泌，肾脏炎性损伤加重，蛋白尿增加。但因本研究样本量较小及临床研究的局限性，具体的通路机制及研究结果仍需要进一步的动物实验及体外实验来揭示和证实。

综上所述，在早期2型糖尿病肾病患者中，持续的血糖波动可能通过持续的氧化应激，导致外周血单核细胞的自噬缺陷，MCP-1分泌增加及血糖波动及氧化应激本身刺激的MCP-1分泌，参与糖尿病肾病的发生发展。因此，在糖尿病肾病的防治中，除了减少血糖波动、抗氧化治疗及抗炎治疗，适当的自噬激活可能是一个新的方向。然而，血糖波动导致自噬缺陷的具体机制还有待于进一步研究。