猪繁殖与呼吸综合征检测技术与疫苗研发进展

高 峰，单衡明，秦志军，张 丹，张 琳，王世军，胡英明

（1.盐城海关，江苏盐城 224002；2.南京农业大学，江苏南京 210095）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），俗称“猪蓝耳病”，由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起，主要表现为不同年龄段猪只的呼吸道综合征、发热、出血，以及母猪流产和产弱仔、死胎或木乃伊胎为特征的繁殖障碍。PRRS 在美国已流行30 多年，在我国已流行20 多年，长期以来一直是一种经济意义重大的流行疾病[1]。PRRSV 基因组长约15 kb，包含11 个开放阅读框（ORF），至少有14 种非结构蛋白（NSP）。NSP2 区30 个氨基酸的不连续缺失被认为是我国高致病性PRRSV（HP-PRRSV）毒株的分子特征。目前PRRSV 普遍存在于国内猪场。Peng 等[2]的调查结果显示，2012—2015 年我国29 个省PRRSV 检出率分别为45.67%、55.99%、56.91% 和59.07%。Xie 等[3]于2017—2018 年在我国27 个省2 428 个猪场的流行病学调查显示，不同地区的PRRSV 检测阳性率为8.12%～29.33%。Guo 等[4]从分子流行病学角度，系统分析了我国PRRSV 流行状况，发现PRRSV-1和PRRSV-2 都在传播，约80%以上的猪场存在PRRSV 血清阳性。其中PRRSV-2 有4 个谱系（谱系1、3、5、8）在田间循环。

PRRS 检测和疫苗免疫在其临床防控中起着重要作用。PRRS 检测技术有很多，其中最主要的是血清抗体ELISA 以及各种类型的PCR 检测技术。每种检测技术的目的有所不同，涉及调查疫苗免疫效率、野毒感染情况、野毒类型以及诊断病例等，市场上的疫苗也有不同类型的单苗及联苗可供选择，因此如何选择合适的检测技术以及合适的疫苗进行PRRS 综合防控具有现实意义。本文就PRRS检测技术和疫苗研发进展进行综述，以期为临床PRRS 综合防控提供依据。

1 实验室检测技术

近年来，PRRS 疫苗免疫以及PRRSV 感染十分普遍。诊断PRRS 首先要看流行病学特点和临床症状。猪群感染PRRSV 后，由于毒株不同、日龄不同、环境差别等，表现出不同的临床症状：母猪以繁殖障碍为主，主要表现怀孕母猪出现大批量流产或早产，产死胎、木乃伊胎以及弱仔增多；后备母猪表现发情率低、屡配不孕、空怀比例高等。除繁殖障碍外，母猪也会出现呼吸道症状及发热，表现为体温升高、呼吸困难、咳嗽，同时表现厌食等，阴唇和耳部等末梢部位呈蓝色或蓝紫色。仔猪表现为严重的呼吸道疾病，主要为呼吸困难、咳嗽、同时表现食欲废绝、高烧，严重的还会出现运动失调，其中哺乳仔猪死亡率较高，可高达80%左右。育肥猪主要表现为一过性厌食、轻度呼吸困难、咳嗽、发热、皮肤发红等[5-7]。但很多时候PRRSV 的感染过程是亚临床的，因此有必要通过实验室技术来检测病毒或特异性抗体。加之我国境内已存在多种毒株，各种年龄的猪均可发病，且病情、症状差异较大，极易与猪附红细胞体病、猪瘟、猪支原体肺炎等混淆[8]。除此之外，持续监测PRRSV 流行株的流行病学和遗传特征，有利于预防和控制其感染。所以对PRRSV 进行实验室检测越来越至关重要。PRRSV 的实验室检测技术最主要的有血清学和分子生物学两种。

1.1 血清学检测

尽管国内规模化猪场普遍使用灭活疫苗和弱毒活疫苗来预防PRRS，但疫苗免疫后的抗体水平参差不齐。抗体水平是反映群体PRRSV 感染与否或免疫是否合格的重要指标。目前，PRRSV 的血清抗体检测技术相对比较成熟，已经有很多商品化试剂盒，比如美国的IDEXX、韩国的金诺以及国内的科前、维德维康等。但各家的试剂盒在敏感性和特异性上都有一些差别。Biernacka 等[9]对比了IDEXX（美国）、Hipra（西班牙）、Ingenasa（西班牙）、Qiagen（德国）、BioNote（韩国）以及ThermoFisher（美国）等 6 个商品化PRRSV 抗体检测试剂盒的敏感性和特异性，发现各试剂盒间存在显著差异。Sattler 等[10]用6 种ELISA 方法，在接种灭活PRRSV-1 型疫苗和随后感染HP-PRRSV野毒株后，检测猪血清中PRRSV 特异性抗体，结果发现在大多数的ELISA 检测中，PRRSV 感染后的S/P值均高于未接种组，只有一种ELISA 方法能够在接种PRRSV 灭活疫苗的猪中检测到可靠的PRRSV 抗体。因此，在进行PRRSV 血清抗体检测时，选择合适的检测试剂盒非常重要。

以上ELISA 检测试剂盒均可检测血清IgG 抗体，但在幼龄仔猪中，ELISA 检测阳性既可能是母源抗体也可能是感染抗体所致。为解决这个问题，Rotolo 等[11]开发了检测唾液中的IgM-IgA PRRSV ELISA 检测方法，并评估了在母源抗体存在下检测猪源PRRSV 抗体的能力，结果确定IgM-IgA ELISA 能够检测出野生型PRRSV 感染产生的抗体。最近，Croft 等[12]对唾液中PRRSV 抗体检测技术进行了改进，并在31 个商业猪场进行了应用，结果准确率达到了98.5%。

1.2 分子生物学检测

荧光定量PCR 敏感性和特异性高，逐渐成为PRRSV 精准检测的主要方法。目前已经建立了基于Nsp2、ORF5和ORF7等基因的荧光定量PCR。但由于PRRS 毒株间的多样性以及共感染等问题，很多猪场均通过RT-PCR 检测，回收目的条带，再送生物公司测序比对，来调查猪场的PRRS毒株类型，这种做法费时费力。近些年，不同毒株的多重PCR 检测在临床诊断和检测中发挥着越来越重要的作用。在鉴别疫苗株和野毒株方面，张文利等[13]针对PPRSV 的Nsp2和ORF7基因区域，分别设计不同荧光标记的MGB 探针及特异性引物，建立了一种能够快速鉴别检测PRRSV GDr180疫苗株与GD 野毒株的双重荧光定量RT-PCR 方法，可用于PRRSV GDrl80疫苗株与野毒株的鉴别检测。在鉴别不同类型毒株方面，Qiu 等[14]根据经典毒株、高致病性毒株和类NADC30 毒株（C-PRRSV）等3 个不同PRRSV 的Nsp2靶基因序列，建立了可同时快速、准确检测和区分上述3 种毒株的多重实时PCR。Yang 等[15]建立的PRRSV 多重RT-PCR 检测技术，能快速鉴别疫苗株JXA1-R、HP-PRRSV和C-PRRSV，其检测灵敏度为24 拷贝/μL。

值得注意的是分子生物学检测体现的是样品中是否存在目标核酸片段。有时虽然存在目标核酸片段，但因引物、反应体系或敏感度等问题，导致检测不出或出现假阴性结果；有时虽然样品中不存在目标核酸片段，但如果猪群中存在，那么采样不合理（方法、数量、猪群选择等）就会产生误导。所以，实验室检测结果必须与临床和病理结合进行综合诊断。

2 疫苗研究进展

2007 年，国际上制定了下一代PRRSV 疫苗新标准，包括快速诱导免疫，对PRRSV 流行毒株提供保护，对猪健康没有不利影响以及可鉴别诊断免疫动物与感染动物等[16]。目前研制的PRRSV 疫苗包括活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA 疫苗以及载体疫苗（表1），但依旧没有符合上述所有标准的PRRSV 疫苗上市。

2.1 活疫苗

目前已经由很多PRRSV-1 和PRRSV-2 的商品化活疫苗（MLV），比如勃林格、硕腾、海博莱等公司的产品[17]。Jeong 等[18]评价了PRRSV-2 活疫苗对韩国PRRSV-1 和PRRSV-2 异种单独攻毒和联合攻毒时的保护力，结果发现接种疫苗后，均能产生较好的抗体，PRRSV 病毒血症均有所下降；PRRSV 特异性IFN-γ 分泌细胞水平较高，且与攻毒对照相比，疫苗免疫后单一攻毒和联合攻毒后的肺损伤和损伤肺的PRRSV 核酸均显著减少。以上说明猪接种PRRSV-2 疫苗对保护猪免受呼吸道疾病是有效的。Han 等[19]对比了活疫苗VR2332 MLV 和HuN4-F112 对PRRS 强毒株ZJnb16-2 的保护效率，结果发现在攻毒前未检测到抗ZJnb16-2的交叉中和抗体，而攻毒后则能检测到，只是抗体效价较低。从临床观察的日增重等指标以及其他指标确定，上述两种疫苗对强毒株ZJnb16-2 感染只有部分保护作用。在免疫时间上，一般认为母源抗体对活疫苗存在一定的干扰，但最新的研究发现，PRRSV-1 和PRRSV-2 活疫苗在1 日龄免疫后，也能产生较好的保护，且PRRSV-1 相比PRRSV-2 的疫苗保护力更好[20]。

表1 PRRSV 疫苗或正在开发的疫苗清单

活疫苗在免疫效力上的缺点是某些疫苗的交叉保护效果不好。Jeong 等[21]发现PRRSV-1 活疫苗不能保护PRRSV-2 的攻击。在国内，针对普遍存在的类NADC30 毒株，目前的活疫苗保护力有限[22]，但也有报道称，部分活疫苗对类NADC30毒株存在部分或完全保护[23-24]。最近，两个诱导I型干扰素产生的PRRS 毒株已经被测试作为候选疫苗[25]。其中PRRSV-A2MC2 是一株中等毒力毒株，与VR-2332 原始毒株的同源性为99.8%，具有很高的核苷酸同源性[26]。

2.2 灭活苗

与活疫苗相比，灭活疫苗具有更高的安全性。但由于其免疫效力差，市场占有率不高。2018年，浙江美保龙高效PRRSV 灭活疫苗上市。该灭活苗通过高抗原含量和肿瘤免疫技术，提高抗原“交叉递呈”效率，确保免疫后能够快速产生PRRSV 抗体，迅速诱导机体产生细胞免疫，快速降低血液和组织中的PRRSV 载量[27]。Nan 等[25]表示PRRSV灭活苗可作为治疗用，而不仅用于预防。虽然多数PRRSV 灭活疫苗的保护效率不高，但加上特异性佐剂，如山药多糖和黄芪多糖[28-29]，就可以提高灭活苗的保护率。最新研究还表明，PRRSV 活疫苗和灭活苗一起使用，可以增强其免疫效果[30-31]。

2.3 亚单位疫苗和DNA 疫苗

除了改良活疫苗和灭活苗外，亚单位疫苗和核酸疫苗等也在研发中。Oh 等[32]用商品化PRRSV 亚单位疫苗，对晚期妊娠母猪异种PRRSV-1 和PRRSV-2 的保护效果进行了评价，将母猪在产前56、35 d（妊娠58、79 d）分别肌内接种，在产前21 d（妊娠93 d）用PRRSV-1 或PRRSV-2进行鼻内攻毒。结果显示：接种疫苗的母猪在妊娠114～115 d 之间产仔，但所有未接种疫苗的母猪在妊娠105～110 d 流产；与未接种的母猪相比，接种的母猪PRRSV 病毒血症水平显著降低（P＜0.05），病毒中和抗体和干扰素γ 分泌细胞水平显著升高（P＜0.05）。这一结果表明，PRRSV 亚单位疫苗用于妊娠晚期的预防是有效的。在DNA疫苗方面，Cui 等[33]的研究发现，GP5 嵌合DNA疫苗对VR2332 和MN184C-PRRSV 株均产生细胞反应性和较高水平的中和抗体，但重组GP5-WT 疫苗只对VR2332 产生免疫应答反应，说明GP5 嵌合DNA 疫苗对异种PRRSV 具有保护作用。

2.4 联苗

目前，越来越多的猪病种类促进了PRRSV 与其他病原的联苗研究。Oh 等[34]在研究PRRSV、圆环病毒2 型（PCV2）和猪肺炎支原体（Mhp）三价疫苗的免疫效力时，发现三价疫苗能有效抵抗Mhp、PCV2 和PRRSV 的三重攻击，但与单苗相比，免疫保护率有所差别。在国内，华威特和硕腾等公司已经有了商品化的PRRSV 和CSFV 二联苗，可以同时防控PRRS 以及CSF。

3 结语

我国PRRS 毒株呈多亚群共存，不同亚群毒株毒力及中和保护位点存在差异，同一亚群毒株毒力及保护位点也有差异等特点，为该病防疫带来了较大压力。因此，通过科学检测以及将严格的生物安全和合理设计的疫苗接种方案结合起来，进行田间毒株检测和基因分析，然后选择相应基因型毒株疫苗进行免疫，对控制农场以及地区的PRRS 具有非常重要的作用。