高效液相色谱法同时测定时行感冒1 号方合剂中6 种有效成分含量

2021-01-06邱盼子肖作奇欧阳波

中国医药导报 2020年33期

邱盼子肖作奇黄涛黄懿潘涛欧阳波

湖南省妇幼保健院药学制剂部，湖南长沙 410008

时行感冒1 号方是湖南省中医药管理局针对新型冠状病毒肺炎推出的中药预防处方，引起了广泛关注和使用。该方由黄芪、桂枝、白芍、苍术、防风、葛根、干姜、甘草、大枣等九味中药组成，具有调和营卫、益气固表的功效[1-2]，适用于易感人群（素体体虚）及高危人群（包括一线医务人员及有接触史的人员）。方中桂枝所含的桂皮醛具有解肌发表、祛风散寒的作用[3-7]；白芍中的芍药苷具有益阴敛营的作用[8-10]；防风所含的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷具有祛风除湿，升脾中清阳的作用[11-12]；葛根素能解肌退热，升阳通经[13-14]；干姜中的6-姜辣素可发散风寒[15]。这些化学成分可以作为时行感冒1 号方的质量控制指标[16]。目前尚无该处方制剂的质量控制标准，其临床用药的安全性与有效性无法得到保障，同时也限制了该处方制剂广泛服务群众。本研究采用高效液相色谱（HPLC）法对该处方中的6 种有效成分进行含量测定，旨在为该制剂的质量控制提供方法依据。

1 仪器与试药

Agilent HP1260 型HPLC 仪，包括G13222 在线脱气机、G1312B 二元泵、G1316A 柱温箱、G1379B DAD检测器、Agilent Open Lab 化学工作站（美国Agilent公司）；TDZ4 低速台式离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

桂皮醛对照品（纯度为99.6%，批号：110710-201821）、葛根素对照品（纯度为95.4%，批号：110752-201816）、升麻素苷（纯度为94.6%，批号：111522-201913）、6-姜辣素（纯度为99.9%，批号：111833-201806）均购自中国食品药品检定研究院；5-O-甲基维斯阿米醇苷（纯度≥98%，批号：Y15D9H77827）购自上海源叶生物科技有限公司；芍药苷（纯度为96.3%，批号：161108-160125）购自江苏永健医药科技有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Tedia 公司）；磷酸、磷酸二氢钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；所有中药饮片均购自湖南省衡东县中药饮片厂。时行感冒1 号方合剂由湖南省妇幼保健院（以下简称“我院”）药学制剂部生产提供；阴性对照样品溶液（按处方药味除去被测药材，其余药味按制剂生产工艺制得）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈（B）:0.1%磷酸水溶液（A），流速：1.0 mL/min，柱温：35℃，检测波长：203 nm，进样量：10 μL。流动相梯度为：0～8 min：90%A；8～13 min：90%→85%A；13～30 min：85%→70%A；30～40 min：70%→50%A；40～45 min：50%A；45～47 min：50%→90%A；47～50 min：90%A。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制分别取葛根素、芍药苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、桂皮醛和6-姜辣素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含191.94、196.07、220.80、214.03、228.68 μg 和434.76 μg的溶液，即得。分别精密吸取葛根素1.5 mL、芍药苷1.5 mL、升麻素苷0.8 mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷0.5 mL、桂皮醛0.25 mL 和6-姜辣素0.05 mL 于5 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得6 种成分的混合对照品溶液。见图1A。

2.2.2 供试品溶液的制备精密吸取时行感冒1 号方合剂（批号：20200222）1 mL 置于5 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，过0.22 μm 有机系微孔滤膜，取续滤液进样分析。见图1B。

2.2.3 阴性对照样品溶液的制备分别按照处方比例制备不含葛根、白芍、防风、桂枝和干姜的阴性对照样品溶液，按“2.2.2”项下方法制备，以“2.1”项下色谱条件进样分析。见图1C。表明阴性对照样品溶液在各组分峰相应的保留时间处均无干扰。

2.3 线性关系考察

配制一系列浓度的标准曲线工作液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，以峰面积A 为纵坐标，进样浓度C（μg/mL）为横坐标进行线性回归，得到标准曲线方程。见表1。

2.4 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液10 μL，重复进样测定6 次，记录峰面积，葛根素RSD 为1.28%，芍药苷RSD 为1.05%，升麻素苷RSD 为1.41%，5-O-甲基维斯阿米醇苷皮醛RSD 为1.37%，6-姜辣素RSD 为1.29%。表明仪器精密度较好。

2.5 重复性试验

精密吸取时行感冒1 号方合剂（批号：20200222）6 份，按“2.2.2”项下方法制得供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件进样，测定含量，葛根素、芍药苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、桂皮醛和6-姜辣素的平均含量分别为722.35、269.36、63.53、45.08、23.28、25.34 μg/mL，RSD 分别为1.37%、1.95%、1.99%、1.89%、1.57%、1.64%。表明该方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 以“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，6 次测定葛根素、芍药苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、桂皮醛、6-姜辣素的峰面积RSD 分别为1.27%、1.65%、1.30%、1.28%、1.07%、1.84%，表明供试品溶液可在室温条件下稳定保存24 h。

2.7 加样回收率试验

精密吸取上述已知含量的时行感冒1 号方合剂（批号：20200222）0.5 mL，置于5 mL 容量瓶中，平行制备6 份，每份各精密加入一定量的葛根素对照品溶液，按“2.2.2”项下方法处理，以“2.1”项下色谱条件进样。精密吸取上述已知含量的时行感冒1 号方合剂（批号：20200222）1 mL，置于5 mL 容量瓶中，平行制备6 份，每份各精密加入一定量的芍药苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、桂皮醛、6-姜辣素对照品溶液，按“2.2.2”项下方法处理，以“2.1”项下色谱条件进样，结果见表2。

2.8 实际样品测定

取5 批样品，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件进样分析，结果见表3。暂定葛根素含量应＞400 μg/mL，芍药苷含量应＞200 μg/mL，升麻素苷含量应＞50 μg/mL，5-O-甲基维斯阿米醇苷含量应＞40 μg/mL，桂皮醛含量应＞15 μg/mL，6-姜辣素含量应＞20 μg/mL。

图1 时行感冒1 号方合剂样品、混合对照品溶液及阴性对照样品溶液色谱图

3 讨论

时行感冒1 号方中共有九味药配伍，全方补中寓散，散不伤正，补不留邪；温中有清，温不助热，清不伤阳[17-21]。我院将该处方做成合剂，既减少了患者的服药量，方便使用携带，又能避免繁琐的煎药流程。

本研究参照文献报道研究方法[22-23]，对各组分的检测波长进行考察，葛根素、芍药苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、桂皮醛和6-姜辣素的最大吸收波长分别为250、220、230、230、290、203 nm，综合比较了6 种组分在不同波长处的出峰情况，结果显示6 种组分在203 nm 处均能得到较高的响应和良好的分离度，故本研究选用203 nm 作为检测波长。由于甲醇在203 nm 处存在末端吸收，所以流动相有机相选择乙腈。本研究还比较了水-乙腈、0.1%磷酸-乙腈、低浓度NaH2PO4-乙腈体系对各目标化合物的影响，结果发现选用0.1%磷酸-乙腈作流动相时，各组分峰响应值及分离效果均优于其他流动相体系。