肺鳞癌组织miRNA-193a 及miRNA-4286 水平与预后的关系

毕 锐 王明松 胡 睿 蒋连勇 杨旭辉 钟 元

上海交通大学医学院附属新华医院心胸外科，上海 200092

肺鳞癌作为肺癌常见病理类型，其化放疗敏感性较低[1-3]。然而肺鳞癌术后患者预后常常较差，所以高效准确的评价肺鳞癌患者术后的预后质量对提高患者术后的生存率，改善患者生活质量具有重要意义[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性非编码小分子RNA，广泛存在于人体中，在基因转录表达中起到重要的调控作用[5-6]。研究报道miRNA 可长期稳定存在且与肿瘤的发生发展密切相关[7-8]，因此miRNA水平的检测对肿瘤的诊断或预后评估具有重要意义。本研究分析了肺鳞癌患者的肺癌组织中miRNA-193a 和miRNA-4286 的表达水平，探讨肺癌组织内miRNA-193a 和miRNA-4286 水平与肺鳞癌患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016 年5 月—2019 年4 月在上海交通大学医学院附属新华医院（以下简称“我院”）确诊且临床资料完整的126 例肺癌患者为研究对象，患者术前均未进行放化疗治疗，肺癌病理类型为鳞癌，经病理复查确认。男74 例，女52 例；年龄32～75 岁，中位年龄为58 岁；组织学分级：高分化鳞癌41 例，中分化鳞癌56 例，低分化鳞癌29 例；参考2009 年国际抗癌联盟（UICC）TNM 分期标准[8]，入组患者Ⅰ～ⅡA 期49 例，ⅡB～Ⅲ期77 例；淋巴转移情况：74 例伴淋巴转移，52 例无淋巴转移；患者随访时间为3～60 个月，平均随访时间为（29.36±10.94）个月。本研究由我院医学伦理委员会批准，所有受试者均同意入组并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

RNA 提取试剂盒（GeneCopoeia 公司，美国）；Allin-one miRNA First-stand Kit（GeneCopoeia 公司，美国）；实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）试剂盒（QIAGEN，德国），实时荧光定量PCR 仪（上海枫岭生物技术有限公司，中国）；Nan-oDrop 2000 分光光度计（赛默飞科技公司，美国）；miRNA-193a、miRNA-4286、内参基因引物（上海生工科技有限公司，中国）：miRNA-193a，上游引物：5′-GCATAA-CTGGCCTACAAAGT-3′；下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGG-3′。miRNA-4286，上游引物：5′-TCTCCTGCACCCCACTCC-3′；下游引物：5′-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3′。内参U6，上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游引物：5′-AAC-GCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用20 μL PCR 反应体系，即2×定量PCR Mix 10 μL，miRNA 上游引物0.08 μL，miRNA 下游引物0.08 μL，cDNA 模板2 μL，TaqDNA 聚合酶（2.5 U/μL）0.4 μL，ddH2O 补充至20 μL。

1.3 实验方法

采用miRNA 提取试剂盒提取并纯化肿瘤组织及癌旁组织（肿瘤组织∶癌旁组织为1∶1）RNA，使用分光光度计检测RNA 浓度。通过实时荧光定量PCR 系统检测miRNA-193a 和miRNA-4286 表达水平，操作规程严格按照试剂盒说明书执行。40 个循环后收集荧光信号，绘制溶解曲线，计算miRNA-193a 和miRNA-4286 相对表达量，计算方法为：miRNA 相对表达量以ΔCT 表示（ΔCT 为循环阈值改变量=CT 内参-CT目标），将肿瘤组织相对表达量比值为1 作为分界值[10]，将全部患者分miRNA-193a 高表达组78 例和低表达组48 例，miRNA-4286 高表达组85 例和低表达组41 例。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，不符合正态分布的计量资料采用中位数表示；计数资料采用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier 统计法及Log-rank 法绘制生存曲线并分析组间差异。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺鳞癌患者肿瘤组织与癌旁组织miRNA-193a和miRNA-4286 表达比较

肺鳞癌组织中miRNA-193a 相对表达量显著低于癌旁组织，但miRNA-4286 表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 肺鳞癌患者肿瘤组织与癌旁组织miRNA-193a和miRNA-4286相对表达量比较（）

表1 肺鳞癌患者肿瘤组织与癌旁组织miRNA-193a和miRNA-4286相对表达量比较（）

2.2 肺鳞癌组织中miRNA-193a 和miRNA-4286 水平与临床病理特征的相关性

肺鳞癌组织内miRNA-193a 和miRNA-4286 水平与年龄、性别、吸烟史和家族史无关联，差异无统计学意义（P ＞0.05），与肿瘤大小、TNM 分期、淋巴结转移和复发情况有关联，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）；肺鳞癌组织内miRNA-193a 与分化程度无关联（P ＞0.05），而miRNA-4286 与分化程度有关联（P ＜0.05）。见表2。

2.3 肺鳞癌组织中miRNA-193a 和miRNA-4286 水平与患者预后的关系

肺鳞癌组织中miRNA-193a 低表达组中位生存期为36 个月（95%CI：0.371～1.198），高表达组中位生存期为54 个月（95%CI：0.834～2.696），差异有统计学意义（P=0.015）；肺鳞癌组织miRNA-4286 低表达组中位生存期为51 个月（95%CI：0.962～2.660），高表达组中位生存期为39 个月（95%CI：0.376～1.039），差异有统计学意义（P=0.005）。见图1。

表2 肺鳞癌组织中miRNA-193a 和miRNA-4286 水平与临床病理特征的相关性[例（%）]

3 讨论

近年来越来越多的研究认为miRNA 可作为诊断[11]、评价预后[12]的重要指标。miRNA 在肺癌发生发展中起着重要的作用，不同miRNA 表达水平与肺癌的诊断、治疗、预后等具有密切的相关性[13]。研究表明，miRNA193a 和miRNA-4286 与肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭等多种肿瘤生物行为密切相关[14-15]。Lin 等[16]研究表明miRNA193a 可抑制结直肠细胞的生长、迁移和血管生成，进而发挥抑癌作用，但也有研究认为miRNA193a可促进肿瘤发生发展[17]；Zhang 等[18]研究发现miRNA-4286 通过激活JAK2/STAT3 通路促进食管癌的进展；另一研究认为miRNA-4286 与胃癌具有相关性[19]。因此这两种miRNA 对肿瘤的具体调控作用仍无定论，可能与肿瘤类型、miRNA 手性等[20]有关。

图1 miRNA-193a 和miRNA-4286 表达水平与肺鳞癌患者预后的Kaplan-Meier 生存曲线

本研究选取126 例肺鳞癌患者，首先发现癌旁组织miRNA-193a 的水平显著高于肺癌组织，癌旁组织miRNA-4286 的水平显著低于肺癌组织，提示miRNA-193a 和miRNA-4286 可能与肿瘤的发生发展有关，且两者对肺癌的作用可能不同。之后研究两种miRNA与各项临床指标的关系，miRNA-193a 和miRNA-4286 水平与肿瘤大小、TNM 分期、淋巴结转移和复发情况有关联，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）；肺鳞癌组织miRNA-193a 表达与分化程度无关联（P ＞0.05），而miRNA-4286 表达与分化程度有关联（P ＜0.05）。通过生存预后分析发现，miRNA-193a 和miRNA-4286 表达与肺鳞癌患者预后密切相关，表现为miRNA-193a 低表达组和miRNA-4286 高表达组预后不良，提示miRNA-193a 可能具有抑癌作用，而miRNA-4286可能具有促癌作用，两者均与患者的预后有关。霍红日等[21]研究发现肺癌患者肿瘤组织miRNA-193a 表达水平显著低于健康体检者，且miRNA-193a 可能是肺癌的诊断指标之一；Ling 等[22]研究发现miRNA-4286 在非小细胞肺癌中过度表达，并负调节PTEN 的表达，进而激活PI3K/AKT 途径促进肺癌细胞的增殖和迁移，这两项研究与本研究结果一致。现如今缺乏miRNA-193a 和miRNA-4286 对肺癌预后评估的研究，但Lin 等[23]研究发现miRNA-193a 表达的降低与大肠癌的预后不良相关，与本研究趋势相似。

综上所述，本研究探讨了miRNA-193a 和miRNA-4286 在肺鳞癌组织中的表达改变，miRNA-193a 可能具有抑癌作用而miRNA-4286 可能具有促癌作用，两者均与患者预后相关。