慢性肾脏疾病进展因素与CD2AP 的关系研究

王琼，刘运广

(1.右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000)

0 引言

慢性肾脏疾病(CKD) 是肾脏结构和功能在多种致病因素作用下发生不可逆、缓慢进行性的改变，其临床表现为肾小球滤过率明显降低或有肾脏损伤的标志，或两者都有，持续至少3 个月。发展至终末期阶段为ESKD，此时肾功能不能长期维持生命，需选择肾脏替代治疗( 以透析或肾移植的形式)，或保守治疗( 也称为姑息治疗或非透析治疗)。2012年根据世界卫组织全球卫生估计，有864 226 例死亡( 占全球死亡人数的15%) 可归因于ESKD。据统计慢性肾脏疾病患病率、死亡率呈逐年增长状态，目前全球估计慢性肾病的患病率为13.4%，在高收入国家( 包括美国和澳大利亚) 的患病率一直报告在11% 左右，在2012 我国一项CKD 的流行病学调查表明成人CKD 患病率高达10.8%。由于慢性肾病通常在疾病进展之前没有症状，目前需要肾脏替代治疗的终末期肾病患者估计在490.2 万至708.3 万之间。因此CKD 是当今我国乃至全球的所面临的严峻的公共卫生问题。慢性肾病的发展与多种因素相关，常见病因继发为高血压、糖尿病、肾炎、遗传性肾病等基础疾病[1-2]。随着研究手段不断改善，遗传因素在肾脏疾病的发生、发展中得到重视。目前已证实有多个基因与肾病的发生密切相关。CD2AP 为其中一个重要之一。本文针对慢性肾病的进展因素、CD2AP与足细胞关系、CD2AP 的概述、CD2AP 与慢性肾病之间的关系作一综述。

1 慢性肾病的进展因素

慢性肾脏疾病最常见的病理表现是肾纤维化。其特征是肾小球硬化、肾小管萎缩和间质纤维化。肾小球硬化是由内皮损伤和功能障碍、平滑肌细胞和系膜细胞增殖以及足细胞破坏引起的。蛋白尿、高血压、高血糖、炎性细胞因子均可损伤足细胞，进而导致足细胞结构及数量改变，进而影响慢性肾病的发生、发展[3]。

2 足细胞与CD2AP

足细胞位于肾小球滤过屏障的外层，是高度特化的终末分化细胞，具有细胞质延伸，即所谓的足突。足细胞在大小和电荷选择性通透性方面有重要作用。足突之间形成特殊的细胞连接即狭缝隔膜 (slit diaphragm，SD) SD 是一种大小选择性的过滤屏障，可以防止大分子物质及细胞流失到肾小球超滤液中，SD 的组成成分主要包括nephrin、neph1、podocin，nephrin 的 羧 基 末 端 与CD2AP、podocin 组 装 形成nephrin-CD2AP-podocin 复 合 物[4]，nephrin-CD2APpodocin 复合物可将裂隙隔膜锚定在肌动蛋白细胞骨架上的关键功能单位，应用共聚焦电镜技术发现，CD2AP 是肾小球裂孔隔膜上的重要成分，同时发现大部分CD2AP 与F—actin 的表达部位重叠。由此推测CD2AP 与F—actin 在足细胞内存在直接相互作用[5]。在一些体外的动物实验中，敲除CD2AP 基因后，足细胞的足突会发生改变，SD 消失，导致大量蛋白尿产生[6]。

3 CD2AP 概述

CD2AP 于1998 年首次被Dustin 等人发现，是一种参与组织免疫突触的蛋白，与CD2 结合并使细胞骨架极化，在识别抗原中起着重要作用[7]。随着研究的深入，发现在全身多个器官组织均有分布，如肾、肠、肝、胃、肺、牙齿、神经组织(背根神经节)、脾、胸腺内皮细胞、淋巴细胞、分化的软骨和骨等[8]。在肾脏主要分布在足细胞上，其编码基因位于第6 号染色体(6p12.3)上，包含18 个外显子。其编码蛋白CD2AP是一种分子质量约80 000、富含SH3 结构的连接蛋白，其氨基末端有3 个连续的SH3 结构域，羧基末端有1 个双螺旋结构域，三个Src 同源3 (SH3)结构域可介导多种蛋白-蛋白相互作用[9]。

4 CD2AP 与慢性肾脏疾病进展因素之间的关系

4.1 CD2AP 与蛋白尿

完全敲除小鼠CD2AP 等位基因，生后1 周即会出现蛋白尿，2 周时出现肾病综合征，6-7 周时死于肾衰竭，进一步发现CD2AP 基因单倍缺失CD2AP+/-的小鼠在出生后9 个月左右出现肾小球病变，提示CD2AP 基因异常使小鼠对肾小球损伤的易感性明显增加[10-11]。蛋白尿表明足细胞之间的足突和隔膜的结构和组成发生了变化。蛋白尿与ESKD 和早期死亡的风险增加相关。毛建华等人发现MCNS 及IgAN 病人肾组织原位Nephrin 及CD2AP 表达有明显下降，而在MCNS 及IgAN 病人Nephrin 及CD2AP 分布变成了颗粒状，可能与肾小球上皮细胞足突的消失、蛋白尿及血浆白蛋白下降程度相关[12]。局部节段性肾小球硬化症FSGS 是肾小球疾病的重要病理类型之一，FSGS 病的发病率在几乎所有的种族群体中、在整个年龄段以及在世界范围内都在上升。它是儿童和成人获得性慢性肾病(CKD)的最重要原因之一，多数对激素治疗不敏感，具有发展为终末期肾病(ESRD)的巨大风险[13]。通过对中国散发性FSGS 患儿行基因测序，发现有2 例杂合突变，分别为2 号外显子第160 位碱基G 被A 替代(160G＞A)、该基因4 号外显子第358 位碱基A 被G 替代(358A＞G)，均导致相应氨基酸发生改变。从而使CD2AP 蛋白表达减少，影响裂孔膜蛋白podocin 的表达[14]。为了验证CD2AP 基因突变可导致肾病的结论的可靠性，通过全外显子组测序，Takano 等人鉴定出CD2AP (p.S198fs) 中的一个纯合的移码突变，该突变发生在三个同系兄弟姐妹中，他们的父母患有儿童期发病的FSGS 病和终末期肾病。当通过基因编辑将相同的移码突变引入小鼠时，小鼠表现出大量蛋白尿，行肾活检提示FSGS 病，最终死于肾衰竭。这些结果为CD2AP 纯合突变导致人类FSGS 病提供了确凿的证据。纯合突变小鼠发展成肾病综合征、FSGS 和ESRD，并明确证明了突变的因果关系[15]。进一步对其可能参与的细胞因子及细胞通路研究发现，在CD2AP-/-小鼠肾脏中，在白蛋白尿发作时足细胞中存在增加的转化生长因子-β1(TGF-β1)表达和细胞凋亡增加[16]。CD2AP 的C 末端区域以激酶依赖的方式直接与TGF-β 受体I 型(TβRI)的胞质尾相互作用，并且TβRI 和PI3K 的p85 亚基之间的相互作用需要CD2AP(30)。TGF-β 也能促进Smad3介导的促凋亡信号传导，Smad2 / 3 缺失的足细胞过度增殖，并且对TGF-β 诱导的生长抑制和凋亡具有抵抗力。在小鼠足细胞Smad3 缺失或CD2AP 杂合的TGF-β1 转基因小鼠。Smad3 缺乏症改善了足细胞凋亡，而CD2AP 杂合性增加了足细胞凋亡和蛋白尿[17]。

4.2 CD2AP 与高血糖

足细胞对于保持肾小球滤过屏障的结构和功能至关重要，有证据表明足细胞的早期丢失促进了DN 的发展[18]。研究发现早期糖尿病大鼠足突间隙长度变宽，裂隙隔膜结构逐渐变形，且呈不均一性；随着病程的延长，糖尿病肾病肾组织CD2AP 密度变得聚集和减少。已经表明CD2AP 的缺失导致TGF-β1 在足细胞中的表达增加和CD2AP -/-小鼠的凋亡[19]。Ha 等人研究发现在小鼠足细胞中，在糖尿病状态通过PI3-K/Akt 信号通路在转录水平诱导内转位并抑制CD2AP 蛋白的产生；同时降低PI3-K 可以诱导细胞凋亡[20]。另外胰岛素抵抗是导致2 型糖尿病发展的主要缺陷。在1 型和2 型糖尿病患者中，易出现胰岛素抵抗与糖尿病肾病。足细胞特异性敲除胰岛素受体导致肾小球病变，CD2AP 的缺乏减弱了足细胞的基础葡萄糖摄取，并降低了胰岛素诱导葡萄糖摄取的作用。CD2AP-/-足细胞中胰岛素反应性葡萄糖转运蛋白4 Glut4 储存囊泡(GSV)转运受损[21]。糖尿病性肾病遗传易感性可能更加明显[22]。CD2AP 变异体与非糖尿病和糖尿病(1 型糖尿病，T1D；2 型糖尿病T2D)肾脏疾病有关。在欧洲1 型糖尿病(T1D)患者中，CD2 相关蛋白基因(CD2AP)中的三个单核苷酸多态性(SNPs) 与ESKD 相关[23]，这是足细胞功能所必需的。相对于欧洲裔美国人(EAs)，非裔美国人(AAs)发展为终末期肾病(ESKD)的风险更高。在进行非裔美国人基因测序中，发现CD2AP 的两个内含子(Rs115912771 和rs116139597) 与T2D-ESKD 相关[24]。

4.3 CD2AP 与高血压

长期血压控制的恶化，患慢性肾脏病和更快进展的慢性肾脏病的风险增加。在动物实验中，发现自发性高血压小鼠肾小球和肾小管间质CD2AP 蛋白水平降低，可能导致肾脏纤维化[25]。在人体实验中发现高血压患者与正常对照组相比，发现高血压组尿沉渣中足细胞足突融合，肾小球nephrin 和/或CD2AP 表达明显降低。这说明高血压导致足细胞损伤并脱离肾小球基底膜，这与尿路检测足细胞一致。同时在患有慢性高血压患者中检测到了尿足细胞，这是足细胞缺失的直接证据[26]。进一步对调节血压的靶向轴研究，发现血管紧张素Ⅱ (Ang Ⅱ) 是肾素 - 管紧张素系统的主要影响因素。同时血管紧张素II (Ang II)是肾小球疾病的关键因素，主要导致足细胞损伤。在小鼠足细胞中，血管紧张素II 处理后，广泛减少CD2AP 表达，并诱导与浓缩肾蛋白的分离。血管紧张素II 以时间和浓度依赖的方式显著降低CD2AP 的表达Ang II 通过AT1R 诱导CD2AP 的重新定位和减少，并且通过抑制CD2AP/PI3-K 信号引起足细胞凋亡[27]。用Ang II 处理人足细胞后，发现并证实Ang II 还可通过激活Arf6-Erk1/2-Nox4信号来促进caspase 3 活性、活性氧(ROX)增加。从而导致人足细胞损伤及凋亡显著增加。另外在Ang II 处理后检测到CD2AP 的减少，CD2AP 的过表达显著抑制Ang II 诱导的活性Arf6-GTP 的升高，表明CD2AP 在抑制人足细胞Arf6 活化中起重要作用[28]。

4.4 CD2AP 与炎性细胞因子通路

Wnt 信号通路与多种人类疾病如炎症、退行性疾病相关。Tankyrases 是具有信号传导和细胞骨架蛋白功能的多功能聚(ADP- 核糖) 聚合酶(PARP) 超家族成员，拮抗Wnt/β-catenin 信号传导。研究数据显示CD2AP-/- 足细胞中β-catenin 的活性增加，淋巴增强因子1(LEF1)(Wnt /β-catenin途径的介质)和纤连蛋白(Wnt /β-catenin 的下游靶标)上调。另外，在没有CD2AP 的情况下，小鼠肾脏和培养的足细胞中，tankyrase 介导的ADP-核糖基化(PARylation)，翻译后修饰涉及肾脏损伤，用坦科聚合酶抑制剂XAV939 抑制PARylation活性后，足细胞总PARylation 和活性β-catenin 降低，LEF1上调，纤连蛋白未见明显变化，诱导与足细胞损伤有关的纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)增加。这表明由CD2AP 维持的tankyrase PARylation 活性的平衡对于正常的肾功能至关重要[29]。白细胞粘附、爬行和迁移受内皮机械敏感受体细胞间粘附分子-1 (ICAM-1)的聚集调节。最近研究发现CD2AP的缺失刺激了ICAM-1 聚集的动力学，这促进了ICAM-1 复合物在内皮细胞表面的形成。导致中性粒细胞粘附增加，爬行减少。CD2AP 是机械敏感的ICAM-1 下游信号传导所必需的，它可以激活PI3K，募集F-肌动蛋白和活性分支蛋白皮质肌动蛋白。此外，CD2AP 对于ICAM-1 诱导的Rac1 募集和激活是必需的[30]。在CD2AP 突变小鼠研究肾小球三种主要细胞类型的变化特性。对于每种主要细胞类型，观察到基因表达中潜在的致病性和保护性转移。在足细胞中，发现足细胞中表达的五种角蛋白基因都被明显下调，内皮细胞中显示出许多有的基因表达发生变化，包括血管收缩剂内皮素(也在系膜细胞中上调)、Bmp4、许多与细胞因子和干扰素反应相关的基因的上调。介导白细胞粘附的Vcam1(血管细胞粘附分子1)和Sele 也上调[31]。这些通路再次验证了细胞炎性因子对足细胞的损伤，同时目前这些通路尚通过动物或离体细胞组织实验得到的，尚不能确定在CD2AP 基因突变后足细胞损伤是是由一种还是多种通路参与，需要继续追踪与研究。

5 展望

CD2AP 作为足细胞裂隙隔膜蛋白之一，可通过上述多因素、多种通路参与慢性肾病进展，这对干预、治疗慢性肾病提供了新的思路。但一种疾病通常是由多种因素、多种通路共同参与的，目前尚未明确进展因素与通路之间有何种关系，CD2AP 作用尚未明确，应尝试开展这些方面的研究，同时结合临床，这对慢性肾脏疾病的治疗具有重要意义。