温度休克和静水压胁迫对鲤卵受精和胚胎亚显微结构的影响

薛淑群，王星然，李池陶，贾智英，韩英，石连玉

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

三倍体鱼生长快、肉质好、抗逆性强、不干扰环境和其他鱼类资源，具有重要的研究价值和广阔的应用前景[1]。

目前多采用温度休克、静水压力休克等物理学方法诱导三倍体鱼类，并在虹鳟Oncorhynchus mykiss、彩鲫Carassius auratus、鲤Cyprinus carpio 等多种养殖鱼类中获得成功[2]。但这两种诱导技术尚不够完善，诱导中受精卵坏死率高、出苗率低、幼鱼畸形高影响了三倍体产业化的发展。目前鱼类三倍体的研究大多集中在诱导技术、性激素水平、营养组成、性腺发育等方面[3]，诱导过程中，外界胁迫对受精卵和胚胎发育的影响尚未见报道。本实验以松浦镜鲤优质受精卵作为研究对象，通过对胚胎亚显微结构的比较，研究三倍体制种方法对受精卵和胚胎是否有诱导损伤、损伤程度及其对胚胎发育的影响，旨在为完善鱼类三倍体制种技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

繁殖用松浦镜鲤亲鱼饲养于黑龙江水产研究所淡水鱼繁育中心，人工催产，干法授精，23～25 ℃水中授精和孵化。

冷休克诱导：人工受精4 min 后，将受精卵转移到0～2 ℃的冰水中，冷休克胁迫15 min，然后置于23～25 ℃水中孵化[4]。

静水压力诱导：将受精卵撒在细目筛网上4 min 后，迅速折叠筛网放入600 kg/cm2压力的静水压力器中，持续处理3 min 后，取出筛网于23～25 ℃的水中继续孵化[5]。

对照组：同批受精卵在23～25 ℃的水中孵化，与诱导组同期取样，做同样分析。

1.2 方法

每组计数100 个受精卵的孵化出膜的鱼苗数量，计算孵化率=出膜苗数/孵化卵数×100%；每组观察100 尾仔鱼，每24 h 记录仔鱼的畸形和死亡情况，计算仔鱼畸形率，连续7d，统计仔鱼死亡率。

鲤胚胎的透射电镜切片按下述方法制作：每组取10 粒经2.5%戊二醛中固定的受精卵，抽去受精卵周围多余空气，使受精卵下沉，固定一周后取出。用pH7.2 的盐酸缓冲溶液反复冲洗，每次15 min，至少三次。置于2%的锇酸固定液再次固定1.5 h后。用pH7.2 的盐酸缓冲液多次冲洗，每次15 min，至少三次。上升梯度的酒精脱水。用体积比1∶1 的丙酮与乙醇混合溶液进行置换。Epon812 包埋剂进行包埋。超薄切片机切片，切片厚度为50 nm。将薄片固定在铜网上，常温下用醋酸双氧铀、柠檬酸铅对薄片进行染色。双蒸水冲去多余染液，晾干。

鲤胚胎的超微组织结构在透射电子显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 鲤受精卵孵化及胚胎发育观察

对照组、冷休克组、静水压组的受精卵孵化率见表1，3 个组受精卵的孵化率分别为76%、51%和39%。

由表1 可知，冷休克组畸形率为15%，死亡率为10%；静水压组畸形率为23%，死亡率为17%。

表1 各实验组鲤受精卵的孵化率和仔鱼畸形率和死亡率Tab.1 Hatching rate of fertilized eggs,and larval abnormal rate and mortality in common carp in each group

2.2 鲤胚胎组织超微结构观察

2.2.1 诱导后3 min 组（图1）

与对照组相比（图1-1），冷休克诱导组胚胎线粒体表面结构完整光滑，略有褶皱，内部呈不均一性变化，线粒体嵴有序结构受到轻微破坏，嵴的高度和半高宽坡度没有明显变化。核糖体排列呈密集趋势（图1-2）。

与对照组（图1-1）相比，静水压力组结构改变明显，线粒体表面结构完整，出现褶皱和明显塌陷，内部呈不均一性变化；线粒体嵴有序结构受到破坏，出现轻微囊泡化现象；核糖体排列密集（图1-3）。

2.2.2 诱导后20 min 组（图2）

与对照组（图2-1）相比，冷休克组鲤胚胎线粒体表面褶皱明显，内部呈不均一性变化;线粒体嵴有序结构受到破坏，线粒体嵴分裂出现轻微囊泡化现象，被破坏的线粒体比例增大，线粒体膜塌陷，无明显肿胀趋势。核糖体排列密集（图2-2）。

与对照组（图2-1）相比，静水压组鲤胚胎损伤明显：线粒体嵴结构被严重破坏，嵴变少甚至消失，大面积囊泡化，细胞损伤尤为明显，被破坏的线粒体比例增大，几乎不存在完整结构的线粒体。核糖体排列异常密集（图2-3）。

2.2.3 诱导后45 min 受精卵细胞质亚显微结构（图3）

与对照组（图3-1）相比，冷休克组鲤胚胎细胞器状态开始逐渐好转，一些线粒体的嵴结构逐渐恢复，线粒体膨胀向球形变化，表面重新变得光滑平整；核糖体排列密集（图3-2）。

静水压组鲤胚胎的线粒体嵴结构开始逐渐恢复，空泡化的线粒体依旧存在，线粒体表面重新变得光滑平整，核糖体排列密集（图3-3）。

2.2.4 诱导后120 min 组（图4）

与对照组（图4-1）相比，冷休克组鲤胚胎线粒体的嵴结构开始逐渐恢复，线粒体表面光滑平整，嵴有序结构恢复正常，细胞器排列与对照组无显著性差异（图4-2）。

与对照组（图4-1）相比，静水压组鲤胚胎细胞器形态继续好转，线粒体的嵴有序结构逐渐恢复，线粒体表面光滑平整，细胞器形态逐渐完整，细胞器排列依旧比较集中，核糖体相对致密（图4-3）。

2.2.5 诱导后24 h 组（图5）

相对于对照组（图5-1），静水压与冷休克胁迫组鲤胚胎细胞器形态与对照组没有差别，线粒体上存在比较完整的内膜结构，细胞器排列不再致密（图5-2 和图5-3）。

静水压与冷休克胁迫组鲤胚胎的细胞器形态与对照组（图6-1）没有差别，线粒体表面重新变得光滑平整，嵴结构有序，细胞器排列与对照组无异（图6-2 和图6-3）。

3 讨论

在23～25 ℃水温下，鲤卵受精后4～5 min 处于第二次有丝分裂期。此期对外界环境胁迫十分敏感，一定的环境胁迫会使微管蛋白解聚，纺锤体消失，第二极体不能排出[6,7]。胁迫撤去，有丝分裂最终会完成，但由于第二极体的排出，使染色体组三倍化[8]。多采用冷休克与静水压方法诱导鱼类的染色体组三倍化，此过程中，受精卵坏死率高、出苗率低、幼鱼畸形等问题[9]，染色体组三倍化诱导方法对受精卵内胚胎发育的影响未见报道，对这一现象产生的机制研究呈现空白，不利于完善三倍化诱导技术。

本研究中，对照组受精卵孵化率76%，冷休克组和静水压组的受精卵分别孵化率为51%和39%；仔鱼畸形率为15%和23%；死亡率10%和17%。诱导鱼染色体三倍化过程中，采用冷休克和静水压诱导均会出现孵化率降低、仔鱼畸形率和死亡率高的现象，静水压组的孵化率更低、仔鱼畸形率和死亡率最高，静水压胁迫对受精卵和胚胎发育的负面影响更显著。

透射电子显微观察到：诱导后3～20 min，诱导组胚胎线粒体等细胞器受损严重，线粒体的内膜与嵴结构也受到不同程度的破坏，其中静水压组更为严重，细胞器空泡化，核糖体异常致密。45 min 后这一现象开始逐渐好转，冷休克与静水压组细胞器形态逐渐好转，45～120 min 诱导组胚胎细胞器损伤水平开始逐渐恢复，空泡化细胞器大量减少，逐渐出现完整结构的线粒体，静水压胁迫组核糖体仍稍显致密；24～48 h 时，诱导组细胞器损伤已经基本恢复，与对照组相比，冷休克与静水压组细胞器形态、数量基本无差异。

吴勤超[10]诱导黄颡鱼多倍体时发现：静水压、冷休克处理组均会产生畸形胚胎，静水压组的畸形率要高于别的处理组。本研究中也观察到了相似现象。冷休克与静水压处理组比，处理强度要温和一些，破坏相对少一些，静水压诱导施加的瞬时外力对受精卵的破坏更难恢复。从线粒体以及其他细胞器形态上看，直到受精后48 h，静水压组才与对照组无显著性差异，而冷休克组在24 h 时就已经显示出完整的细胞器形态。以上现象表明，胁迫诱导对胚胎超微结构造成了一定的影响，在一定时间内，冷休克与静水压胁迫细胞器的损伤会逐渐恢复，静水压胁迫对胚胎发育影响更为显著。

在冷休克与静水压胁迫下，胚胎的蛋白构象被破坏，部分蛋白失活、变性，蛋白复合体也会受到损伤，生物活性降低甚至失活。机体为了应对这种胁迫，需要产生应激蛋白，以帮助受损的蛋白恢复构象与活性，帮助失活的蛋白降解以及新蛋白的合成装配[11]。受精卵会消耗部分胚胎发育的能量用于自身受损修复，影响正常发育，这可能是诱导三倍体过程中孵化率偏低的重要原因[12]。冷休克对胚胎的损伤更温和，更容易恢复，静水压诱导施加的瞬时外力会对诱导起到很好的效果，静水压诱导鱼染色体三倍化是目前诱导率最高的方法，但这也会对受精卵造成更难恢复的破坏[13]，相对与冷休克温差的变化，压力胁迫更为剧烈，也更难以恢复。在一定时间内，冷休克与静水压胁迫对细胞器的损伤会逐渐恢复，静水压胁迫对胚胎发育影响更为显著。吴勤超发现，静水压诱导会得到更低的孵化率与更高的畸形率，因此，认为静水压会胚胎产生更大的破坏，这与本实验结论一致。静水压诱导胁迫对受精卵的应激损伤大于冷休克，对受精卵和胚胎发育的负面影响更为显著，需要更长的恢复期[14]。

本研究通过对胚胎亚显微结构的比较，研究三倍体制种方法对受精卵和胚胎发育是否造成诱导损伤、损伤程度及其对胚胎发育的影响，旨在为鱼类三倍体制种技术的完善提供理论依据。