依托咪酯通过调节Hippo信号通路抑制鼻咽癌细胞CNE-1和HNE-1的侵袭迁移

陈明明，李克寒，刘相乐，姚晶，马慧颖

(1.河南科技大学第一附属医院麻醉科，河南 洛阳 471000； 2.洛阳市第三人民医院麻醉科，河南 洛阳 471000)

鼻咽癌是最常见的头颈部肿瘤之一，是一种发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤。由于其区域分布和家族聚集，主要在中国南部和东南亚国家流行[1]。由于鼻咽区域中复杂的解剖结构，在这种类型的癌症中很少进行手术，并且化学疗法受到各种严重副作用的限制[2]。近年来癌症治疗手段取得不少进步，但鼻咽癌患者的5年生存率仍然徘徊在50%～70%[3]。因此，迫切需要开发能够治疗鼻咽癌的新药物。先前的研究表明，一些麻醉剂不仅通过阻断围手术期应激反应，而且还通过诱导抗癌效应来抑制癌症转移[4]。依托咪酯是一种催眠性静脉全麻药，是咪唑类衍生物，由于其安全性高，是麻醉诱导常用的药物之一。已有研究表明，依托咪酯抑制A549肺腺癌细胞的侵袭和迁移[5]，但依托咪酯对鼻咽癌的作用尚不清楚。Hippo信号通路是一个调节器官大小、组织再生和癌症的关键信号通路，已有研究证明Hippo通路参与鼻咽癌细胞上皮间质转化[6]。本文主要研究依托咪酯通过调节Hippo信号通路对鼻咽癌细胞CNE-1和HNE-1的侵袭迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

顺铂(浙江联硕生物科技有限公司，批号：PHR1624)，依托咪酯(HPLC≥99%，上海麦克林生物技术股份有限公司，批号：33125-97-2)，RPMI-1640培养液(上海栩冉生物科技有限公司，批号：C22400500BT)，胎牛血清(素尔生物科技有限公司，批号：16000-044)，MTT试剂盒(上海泽叶生物科技有限公司，批号：ZY111105)，RIPA裂解缓冲液(南京海克尔生物科技有限公司，批号：SBJ-0999)，BCA试剂盒(上海易色医疗科技有限公司，批号：BC201)，辣根过氧化物酶标记的二抗、SGK3抗体、MST抗体、p-MST抗体、LAST抗体、p-LAST抗体、YAP抗体、p-YAP抗体(上海艾博抗生物科技有限公司，批号： ab6728、ab126108、ab85377、ab79199、ab70561、ab111344、ab205270、ab76252),Transwell小室(北京优尼康生物科技有限公司，批号：3422)，XMU-MP-1(Selleckchem，批号#S8334,)。

1.2 细胞培养

鼻咽癌细胞CNE-1和HNE-1购自上海复祥生物科技有限公司。鼻咽癌细胞CNE-1和HNE-1细胞在37 ℃、体积分数为5%CO2条件下，于含有体积分数为10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。

1.3 MTT法检测细胞活性

在96孔板中，将鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞分别用不同浓度(0、5、10、20、40、80、160 μmol/L)处理12 h、24 h、48 h时，再用10 μL MTT染料处理细胞，然后与100 μL二甲基亚砜孵育15 min，用酶免疫分析仪在490 nm处测量吸光度。用各浓度处理组细胞吸光值与0 μmol/L组细胞的吸光度表示细胞活性。

1.4 分组及处理

将鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞分别分为对照组、依托咪酯低剂量组、依托咪酯中剂量组、依托咪酯高剂量组、顺铂组、Hippo通路抑制剂(XMU-MP-1)组、依托咪酯高剂量+XMU-MP-1组。对照组、依托咪酯低、中、高剂量组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞用终浓度含有依托咪酯 0、10、20、40 μg/mL培养基培养；顺铂组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞用终浓度含有Cisplatin 10 μg/mL培养基培养；Hippo通路抑制剂组和依托咪酯高剂量+XMU-MP-1组鼻咽癌细胞CNE-1和HNE-1用终浓度含有XMU-MP-1 10 μg/mL和依托咪酯 0、40 μg/mL培养基培养。

1.5 划痕实验检测细胞迁移能力

将各组转染的鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞以1×106细胞/孔的密度接种在12孔板中，铺满单层后，用小号枪头垂直在孔中间划痕。在CO2体积分数为5%、37 ℃恒温的培养箱培养24 h后。在划痕0 h和24 h拍摄的图像，使用ImageJ评估细胞迁移能力。细胞迁移率(%)=(0 h时的划痕面积-24 h时的划痕面积)/0 h的划痕面积×100%。

1.6 Transwell实验检测细胞侵袭

在 Transwell 小室中铺 40 μL matrigel 基质胶，在细胞培养箱中使其凝固，然后在Transwell小室上室接种鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞悬浮液和不含血清的培养基，终浓度为 2.5×105个/mL，并在Transwell小室下室加入含血清和丝裂霉素C的培养基，培养24 h后，取出Transwell 小室，用结晶紫染色，并在显微镜下观察分析。

1.7 蛋白质印迹分析检测p-MST、p-LATS、p-YAP、MST、LATS、YAP蛋白表达水平

在裂解缓冲液中提取总蛋白质，并用BCA测定试剂盒测量蛋白质浓度。将10 μg 蛋白样品用10% SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜上。 用5%脱脂奶粉封闭膜，然后用一抗(p-MST 1∶500、p-LATS 1∶500、p-YAP 1∶10 000、MST1∶100、LATS 1∶5000、YAP 1∶1000)在4 ℃封闭过夜，接着加入对应辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育1 h，最后滴ECL曝光)，然后再次用TBST洗涤3次。 使用ECL系统检测结合的抗体。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 依托咪酯对鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞存活率的影响

随着依托咪酯浓度的增加，鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞活性明显下降；随着培养时间增加，鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞活性逐渐下降。当依托咪酯浓度为 5、10、20、40 μg/mL时，鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞活性>80%，毒性较低。因此，本研究选择依托咪酯10、20、40 μg/mL作后续研究。当浓度相同时，24 h和48 h与12 h比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；而24 h 和48 h之间比较无明显差异，因此，选择药物作用时间24 h作后续实验。见图1。

2.2 依托咪酯对鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞迁移的影响

与对照组相比，依托咪酯低剂量组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞迁移率无明显差异，依托咪酯中剂量组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞迁移率有所减少(P<0.05)，依托咪酯高剂量组和顺铂组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞迁移率明显减少(P<0.01)。见图2。

2.3 依托咪酯对鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞侵袭的影响

与对照组相比，依托咪酯低剂量组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞侵袭细胞数目无明显差异，依托咪酯中剂量组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞侵袭细胞数目有所减少(P<0.05)，依托咪酯高剂量组和顺铂组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞侵袭细胞数目明显减少(P<0.01)。见图3。

2.4 依托咪酯对鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞Hippo信号通路的影响

与对照组相比，依托咪酯低剂量组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表达无明显差异，依托咪酯中剂量组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表达有所上调(P<0.05)，依托咪酯高剂量组和顺铂组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表达明显上调(P<0.01)。见图4。

A. MTT法检测鼻咽癌CNE-1细胞活性； B. MTT法检测鼻咽癌HNE-1细胞活性。

A.划痕实验检测鼻咽癌CNE-1细胞迁移; B.划痕实验检测鼻咽癌HNE-1细胞迁移; 与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

A. Transwell实验检测鼻咽癌CNE-1细胞侵袭; B. Transwell实验检测鼻咽癌HNE-1细胞侵袭; 与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

2.5 XMU-MP-1对依托咪酯激活Hippo信号通路的影响

与对照组相比，XMU-MP-1组p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表达明显下调(P<0.05)；与依托咪酯高剂量组相比，依托咪酯高剂量+XMU-MP-1组p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表达明显下调(P<0.01)；见图5。

2.6 XMU-MP-1对依托咪酯抑制鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞迁移的影响

与对照组相比，在XMU-MP-1组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞迁移率明显增加(P<0.05)；与依托咪酯高剂量组相比，在依托咪酯高剂量+XMU-MP-1组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞迁移率明显增加(P<0.01)。见图6。

2.7 XMU-MP-1对依托咪酯抑制鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞侵袭的影响

与对照组相比，在XMU-MP-1组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞侵袭细胞数目明显增加(P<0.05)；与依托咪酯高剂量组相比，在依托咪酯高剂量+XMU-MP-1组鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞侵袭细胞数目明显增加(P<0.01)。见图7。

3 讨论

鼻咽癌是最具侵袭性的头颈部鳞状细胞癌之一，经常转移到远处的淋巴结和器官。由于鼻咽癌致死率高，治疗后生活质量低，且鼻咽癌复发率高，所以该病的治疗仍是一个具有挑战性的临床问题[7]。顺铂是一种铂类抗肿瘤化疗药物，用于治疗包括鼻咽癌在内的多种实体恶性肿瘤。虽然具有较高的初始响应性，但多数鼻咽癌患者不久就会出现获得性耐药，最终导致复发或转移。麻醉剂可通过诱导抗癌效应来抑制癌症转移[8]。依托咪酯减少心血管副作用并能够维持麻醉期间的血流动力学的稳定性，是临床上理想的镇静和麻醉药。

A.蛋白印迹法检测鼻咽癌CNE-1细胞Hippo信号通路相关蛋白表达水平; B.蛋白印迹法检测鼻咽癌HNE-1细胞Hippo信号通路相关蛋白表达水平; 与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

A.蛋白印迹法检测鼻咽癌CNE-1细胞Hippo信号通路相关蛋白表达水平; B.蛋白印迹法检测鼻咽癌HNE-1细胞Hippo信号通路相关蛋白表达水平; 与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01; 与依托咪酯高剂量组比较：##P<0.01。

A.划痕实验检测鼻咽癌CNE-1细胞迁移; B.划痕实验检测鼻咽癌HNE-1细胞迁移; 与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01; 与依托咪酯高剂量组比较：##P<0.01。

A. Transwell实验检测鼻咽癌CNE-1细胞侵袭; B. Transwell实验检测鼻咽癌HNE-1细胞侵袭; 与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01; 与依托咪酯高剂量组比较：##P<0.01。

临床发现长期应用依托咪酯会引起免疫抑制作用以及增加细胞毒效应的作用[9]。已有研究表明，依托咪酯可具有直接诱导人肝癌HepG2细胞体外凋亡的作用[10]，依托咪酯抑制A549肺腺癌细胞的侵袭和迁移[5]。因此，依托咪酯具有抗癌作用。鼻咽癌高复发和高转移与肿瘤细胞的侵袭和迁移能力密切相关，有效抑制人鼻咽癌细胞的侵袭和迁移可以抑制鼻咽癌的发展，如，蛇床子素可抑制CNE2细胞的增殖、侵袭和迁移，其机制可能与调节Wnt/β-catenin信号通路进而抑制EMT过程有关[11]；甲基莲心碱通过抑制miR-423-5p的表达作用于下游靶基因SMIM3、NGF，抑制上皮间质转化相关蛋白的表达，从而抑制鼻咽癌细胞的侵袭转移[12]。本文研究发现，依托咪酯抑制鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞的迁移侵袭，其与Hippo通路激活有关。

Hippo通路响应多种细胞外和细胞内信号，从细胞间的接触和机械信号到G蛋白偶联受体的配体和代谢通路。近年来研究发现，Hippo信号通路能够协调细胞增殖、细胞死亡和细胞分化，调控组织生长的一个高度保守的生长控制信号通路[13]。Hippo通路的核心包含一个核心激酶盒，该核心盒由一对相关的丝氨酸/苏氨酸激酶、MST1和MST2组成[14]。Hippo信号通路上游膜蛋白受体作为胞外生长抑制信号的感受器，一旦感受到胞外生长抑制信号，就会激活一系列激酶级联磷酸化反应，最终磷酸化下游效应因子YAP和TAZ[15]。而细胞骨架蛋白会与磷酸化后的YAP和TAZ结合，使它滞留在细胞质内，并刺激它们的泛素介导的蛋白水解作用，降低其细胞核活性，从而实现对细胞生长的调控[16]。 本文研究发现，依托咪酯上调鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞中p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表达。当Hippo通路被激活时，其功能相当于肿瘤抑制因子。然而，这一途径的失调有助于增加细胞增殖，减少细胞凋亡和分化。因此，通过药理学调节剂调控Hippo信号可能是一种有前途的抗癌策略[17]。Hippo通路具有独特的致瘤能力，其核心成分(MST1/2、LATS1/2、YAP和TAZ)的突变和表达改变促进了癌细胞的迁移、侵袭和恶性[18]。如，非受体酪氨酸磷酸酶14通过调节Hippo信号通路YAP的磷酸化来促进胃癌细胞的增殖和迁移[19]。已有研究发现，Hippo通路参与鼻咽癌细胞上皮间质转化[6]，低浓度佛手柑内酯能显著抑制鼻咽癌的肿瘤干细胞特性，其可能原因与激活肿瘤细胞中Hippo信号通路相关[20]。本文研究发现，添加Hippo通路抑制剂XMU-MP-1可下调p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表达，促进鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞的迁移侵袭，同时逆转依托咪酯对鼻咽癌CNE-1和HNE-1细胞的迁移侵袭的抑制作用。

综上所述，本文研究发现依托咪酯通过调节Hippo信号通路抑制鼻咽癌细胞CNE-1和HNE-1的侵袭迁移，因此，依托咪酯有望成为鼻咽癌治疗的新药物。本研究仅为体外细胞实验和机制的初步探讨，体内实验有待进一步研究。