二氧化硅包覆银铜纳米颗粒的结构及其抗菌性能

姜兴茂， 刘 奇， 郭 琳

(武汉工程大学 化工与制药学院， 湖北 武汉 430000)

近年来，人类大量使用抗生素，导致越来越多的细菌产生单一耐药性甚至多重耐药性。细菌耐药成为人类健康的巨大威胁，若仅仅采用普通治疗手段，细菌感染便会再次危害人类的生命安全，因此，寻找新的抗菌物质成为当前科研人员研究的一个热点。金属纳米材料因具有大的比表面积和独特的物理化学性质，使其在催化[1]、抗菌[2-3]等方面的应用前景广受关注，一些具有抗菌能力的金属纳米粒子被研究人员相继发现，如纳米银、纳米铜等。

纳米银是常见的广谱抗菌剂，拥有很好的生物相容性，可以抑制多种细菌生长，并且不产生耐药性[4]。为了探索金属纳米颗粒对细菌的杀菌过程，人们开始研究金属纳米颗粒的杀菌机制，发现活性氧的生成和银纳米颗粒溶解释放Ag+导致细菌死亡是当前普遍认同的抗菌机制[5-6]。铜是一种毒性较低的药物，在抗菌治疗中应用十分广泛[7]。铜[8]、氧化铜[9-10]、氧化亚铜[11]均可用于抗菌。一些研究表明：和银相比，铜对细菌生长的抑制作用更为显著[12]。铜纳米颗粒有多种杀菌机制，如：破坏细胞膜，损伤脱氧核糖核酸(DNA)，抑制蛋白质的合成及阻断不同的生化途径[13]。研究人员发现：与铜、银纳米颗粒相比较，银铜双金属纳米颗粒对细菌产生更强的抗菌活性。抗菌活性由强到弱依次为：银铜双金属纳米颗粒，银纳米颗粒，银、铜纳米颗粒混合，铜纳米颗粒[14]。Perdikaki等[15]发现，对大肠杆菌而言，双金属Ag/Cu纳米颗粒-石墨烯杂化物比Ag-石墨烯杂化物、Cu-石墨烯杂化物具有更好的抗菌性能，归因于表面上2种不同金属之间的协同作用。银铜双金属纳米颗粒卓越的抗菌活性得到研究人员广泛的关注。由于金属纳米颗粒容易团聚导致抗菌性能减弱，因此采用无毒载体包裹[16]或负载[17]金属纳米粒子，避免金属纳米粒子聚集。载体的加入可以起到缓释作用进而使抗菌剂达到长效抗菌的效果。

纳米二氧化硅球具有较好的生物相容性且制备容易，因此，在生物医药领域一般使用二氧化硅作为载体。目前，人们通常采用两步法制备二氧化硅负载单金属纳米颗粒[7,18]：第1步制备二氧化硅纳米球；第2步将金属纳米颗粒沉积在二氧化硅纳米球上。Isaacs等[19]采用反向微乳法制备了Ag/SiO2纳米颗粒。上述材料制备方法均较为烦琐，需要多步处理且只能负载1种金属纳米颗粒。气溶胶法是将配制好的前驱体溶液通过雾化器雾化为气溶胶小液滴，再由载气送入管式炉内，液滴在管式炉内蒸发、结晶、干燥、分解反应、烧结并生成纳米颗粒，最终得到纳米粒子的一种方法。气溶胶法是工业主导的纳米粒子制备方法，具有可连续生产，扩大容易，纯度高，颗粒球形度高，无需反复洗涤干燥，产品直接收集，环境友好等优点。

本文采用气溶胶蒸发自组装技术制备“火龙果”型高负载量Ag-Cu/SiO2纳米颗粒。与单金属Ag、Cu/SiO2纳米颗粒的抗菌性能对比发现，双金属Ag-Cu/SiO2纳米颗粒对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌及革兰氏阴性的大肠杆菌均展现了更好的抗菌活性。同时，通过研究细菌胞内活性氧的变化，进一步探索了双金属纳米颗粒的协同抗菌机制。

1 实验部分

1.1 实验原料

硝酸银(AgNO3，纯度≥99.95%)、硝酸铜(Cu(NO3)2·3H2O)、无水乙醇、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES，纯度为99%)，武汉格奥化学技术有限公司；硝酸(含量为66%～68%)，武汉致远天合化工有限公司；牛肉膏、蛋白胨，生化试剂，北京双旋微生物培养基制品厂；2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA，纯度≥97%)，阿拉丁试剂有限公司。

菌种：金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(S.aureus, ATCC9118)、大肠杆菌Escherichiacoli(E.coli, CCTCC AB 93454)，均由武汉工程大学环境生态与生物工程学院提供。

1.2 实验仪器

OTL-1200型高温管式炉(南京博蕴通仪器科技有限公司)；2极1500X4型空气压缩机(台州市奥突斯工贸有限公司)；SPH-200型氢气发生器(北京中惠普分析技术研究所)；BDL-A3型氮气机(石家庄邦力机电设备有限公司)；THZ-系列恒温培养摇床(上海一恒科技有限公司)；722E型紫外可见分光光度计(天津市普瑞仪器有限公司)；F-7100 FL型荧光光谱仪(日本日立公司)。

1.3 Ag/SiO2、Cu/SiO2、Ag-Cu/SiO2的制备

以负载量50%双金属Ag-Cu/SiO2制备为例。

前驱体的制备：称取0.926 9 g Cu(NO3)2·3H2O、0.651 1 g AgNO3溶解于25 mL去离子水中，其中Ag和Cu的量比为1∶1，搅拌使其完全溶解；以APTES为硅源，量取4.857 8 g APTES分散在12.66 mL无水乙醇中，将金属盐溶液与硅烷醇溶液混合均匀，之后向其中加入0.09 g硝酸，超声振荡5 min，然后使用磁力搅拌器搅拌，配制成为前驱体溶液。各原料APTES、 H2O、 EtOH 和 HNO3的量比为1∶63.3∶9.9∶0.044 。

采用气溶胶法制备Ag-Cu/SiO2，实验流程如图1所示，以混合气(氮气与氢气，载气压力为0.2 MPa)为载气。首先，将前驱体溶液雾化成微小的气溶胶液滴，由混合载气将其送入600 ℃的管式炉中，气溶胶液滴在其中经过蒸发、结晶、热解、烧结/熔融等一系列过程，再在管式炉出口处通以大量氮气进行冷却、稀释，生成固体粉末，最后由收样器中的滤纸收集固体粉末，该产物就是负载量为50%的Ag-Cu/SiO2纳米颗粒。

Ag/SiO2、Cu/SiO2的制备与其类似。称取1.037 g AgNO3制备负载量为50%的Ag/SiO2，称取2.491 g Cu(NO3)2·3H2O制备负载量为50%的Cu/SiO2。

图1 采用气溶胶法制备纳米颗粒工艺流程示意图Fig.1 Schematic diagram of process flow for preparing nanoparticles by aerosol method

1.4 材料表征

所制备的样品通过X射线粉末衍射仪(XRD，Bruker axs D8 Discover)进行表征，扫描范围为5°～90°，Kα射线(波长为 0.154 056 nm)。使用FALCON60型能谱仪(EDS)测定样品中各元素的质量分数。使用Tecnai G2 F20 S-TWIN TMP型透射电镜(TEM)观察样品形貌。使用722E型可见分光光度计测定细菌悬浮液的吸光度(OD值)。使用F-7100 FL型荧光光谱仪测定细菌细胞内活性氧的荧光强度。

1.5 抗菌测试

通过测试所制备的负载量为50%的Ag/SiO2、Cu/SiO2、Ag-Cu/SiO2纳米颗粒对S.aureus及E.coli的最低抑菌浓度(MIC)和时间-杀菌曲线来评价其抗菌性能。其中，灭菌处理后的牛肉膏蛋白胨培养基和营养琼脂培养基用来培养所需的细菌。

1.5.1 最低抑菌浓度(MIC)的测定

通过常量稀释法测定细菌的MIC值。首先将抗菌材料配制成1 mg/mL，之后将细菌接种于培养基中，接着在恒温培养摇床(37 ℃)中培养16～20 h，把培养之后的细菌悬浮液用磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释至108CFU/mL(通过分光光度计调节吸光度OD600为0.12左右)。首先向试管中加入培养基0.9 mL，再向试管中加入适当的PBS(PBS的量由加入抗菌材料的体积决定，保证溶液总体积为2 mL)，之后加入抗菌材料，接着向试管中滴加100 μL细菌悬浮液(保证细菌悬浮液细菌浓度为5×105CFU/mL左右)，最后在摇床中培养24 h。培养完成后观察试管的浑浊度，细菌悬浮液不浑浊且透明时对应的抗菌材料最低浓度即为MIC值。实验重复测试3次。

1.5.2 时间-杀菌曲线绘制

选取Ag-Cu/SiO2纳米颗粒对S.aureus及E.coli的MIC值为抗菌浓度，研究Ag-Cu/SiO2、Cu/SiO2、Ag/SiO2纳米颗粒对细菌的时间-杀菌曲线。用PBS溶液稀释细菌悬浮液，使菌液浓度约为108CFU/mL，向灭菌锥形瓶中加入牛肉膏蛋白胨培养基及PBS溶液，再向锥形瓶中分别加入40 μL抗菌材料(Ag-Cu/SiO2、Cu/SiO2、Ag/SiO2)，加入5×105CFU/mL的细菌菌液，保证总体积为20 mL。未添加抗菌材料的为对照组。接着在37 ℃，200 r/min摇床内培养，取0、4、8、12、16、20、24 h时间点的少许菌液，测定细菌悬浮液的OD600值，并绘制时间-杀菌曲线，实验重复测定3次。通过测定细菌悬浮液的OD值可以判断细菌浓度，OD值越低，细菌含量越少。

1.5.3 细胞内活性氧(ROS)的测定

挑取单独菌落于培养基中并在37 ℃摇床中培养16～20 h，用PBS稀释至108CFU/mL，将负载量为50%的Ag-Cu/SiO2、Cu/SiO2、Ag/SiO2加入到相同体积的菌液中，使材料质量浓度为2 μg/mL，未添加抗菌材料的细菌悬浮液为对照组。在37 ℃条件下培养6 h后，5 000 r/min离心5 min收集细菌细胞，并倒出上清液。将2, 7-二氯二氢荧光素二乙酸酯溶液(10 μmol/L DCFH-DA)加入到样品管中，于37 ℃条件下培养20 min，倒出上清液并洗涤样品3次，保证去除多余的DCFH-DA，以增强测试结果的准确性。使用荧光光谱仪测定样品荧光强度(激发波长为450 nm，发射波长为535 nm)，实验重复测定3次。通过测定细菌悬浮液的荧光强度来评价细菌胞内活性氧生成水平，由于细菌培养液的荧光强度与细菌细胞内ROS含量成正比，因此由荧光强度便可判断细菌胞内ROS含量的高低。

2 结果与讨论

2.1 二氧化硅包覆金属颗粒的表征分析

图2分别示出负载量为50%的Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2、Cu/SiO2的XRD图谱。可知，这3种材料在2θ为23°处都有一个宽而大的峰，是SiO2标准特征峰，说明样品中SiO2均是无定形的。图2(a)为Ag-Cu/SiO2的XRD图谱，可知样品中存在单质银特征峰(JCPDS 87-717 Ag)，分别对应立方晶系银的(111)，(200)，(220)，(311)晶面。从XRD图谱看不出单质Cu的特征峰，这是因为Cu被SiO2包覆使其3个主峰位特征峰不明显，但不影响单质Ag特征峰的出现。图2(b)为Ag/SiO2的XRD图谱，样品中存在单质银特征峰(JCPDS 87-717 Ag)，且对应立方晶系银的(111)，(200)，(220)，(311)晶面。图2(c)为Cu/SiO2的XRD图谱，图谱中没有观察到Cu的特征峰，这是因为Cu被SiO2包覆使其特征峰不明显。为了进一步说明样品中存在相应的金属元素，将上述3种样品进行EDS表征。图3分别示出负载量为50%的Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2、Cu/SiO2的EDS能谱图。图3(a)显示，在Ag-Cu/SiO2中，含有银铜2种金属，说明Ag-Cu/SiO2纳米颗粒制备成功。从图3(b)看出Ag/SiO2中只含有银，说明Ag/SiO2制备成功。从图3(c)可以看到材料中含有铜元素，说明Cu/SiO2颗粒制备成功。

图2 Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2、Cu/SiO2的XRD图谱Fig.2 XRD pattern of Ag-Cu/SiO2 , Ag/SiO2 and Cu/SiO2

图3 二氧化硅包覆金属纳米颗粒的EDS能谱图Fig.3 EDS energy spectrum of silica-coated metal nanoparticles

对3种材料的形貌和金属纳米颗粒粒径进行表征。图4示出Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2、Cu/SiO2纳米颗粒的TEM照片。可看出，这3种样品均是SiO2球包覆金属纳米粒子的结构，金属粒子分散较为均匀。图5分别示出3种纳米颗粒的粒径分布图。由图可知：银铜双金属纳米颗粒平均粒径约为11 nm；银纳米颗粒的平均粒径为6.18 nm；铜纳米颗粒的平均粒径为3.31 nm。可见，成功制备出具有“火龙果型”结构的Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2、Cu/SiO2纳米颗粒。

图4 二氧化硅包覆金属纳米颗粒的TEM照片Fig.4 TEM images of silica-coated metal nanoparticles

图5 二氧化硅包覆金属纳米颗粒的粒径分布图Fig.5 Particle size distribution of silica-coated metal nanoparticles

2.2 抗菌活性对比

通过最低抑菌浓度(MIC)实验，研究了Ag-Cu/SiO2、Cu/SiO2、Ag/SiO2及SiO2纳米颗粒对S.aureus和E.coli的抗菌活性。表1示出这几种纳米材料对S.aureus及E.coli的MIC值，其中Cu/SiO2及SiO2纳米颗粒的MIC值均大于256 μg/mL，Ag/SiO2对S.aureus的MIC值为8 μg/mL，对E.coli的MIC值为4 μg/mL，Ag-Cu/SiO2对2种细菌的MIC值均为2 μg/mL。可知，双金属Ag-Cu/SiO2相比Cu/SiO2、Ag/SiO2及SiO2纳米颗粒，展现了更强的抗菌活性，这是因为银铜之间的协同效应使抗菌活性加强[15,20-21]。制备的Ag-Cu/SiO2双金属纳米抗菌剂的抗菌活性比已经报道的其他双金属纳米抗菌剂的抗菌活性要强[22-23]。

表1 不同二氧化硅包覆金属纳米颗粒对S.aureus和E.coli的最低抑菌浓度 μg/mL

图6 Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2和Cu/SiO2对S.aureus和E.coli的时间-杀菌曲线Fig.6 Time-kill curves of S.aureus and E.coli treated with Ag-Cu/SiO2, Ag/SiO2 and Cu/SiO2

2.3 时间-杀菌曲线分析

通过检测细菌悬浮液的吸光度(OD600)，绘制了Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2、Cu/SiO2对S.aureus及E.coli的时间-杀菌曲线，如图6所示。

从图6(a)可以看出：对S.aureus而言，对照组和加入Cu/SiO2纳米颗粒的培养液中细菌浓度在0～4 h增长缓慢，4～8 h急速增长，8～12 h放缓增长，12～24 h停止增长；加入Ag/SiO2纳米颗粒的培养液，在0～4 h可以抑制细菌的生长，但之后细菌便快速增长；加入双金属纳米颗粒Ag-Cu/SiO2的培养液，在24 h内细菌的含量很低，能够充分抑制细菌的增长。从图6(b)可以看出，对E.coli而言，对照组和加入Cu/SiO2纳米颗粒的杀菌曲线趋势基本一致，培养液中细菌在24 h内不断生长；加入Ag/SiO2纳米颗粒的培养液，在0～16 h能够抑制细菌生长，细菌在20 h之后增长速度变快；加入双金属纳米颗粒Ag-Cu/SiO2的培养液，在24 h内细菌的含量很低，能够充分抑制细菌的增长。与Ag/SiO2和Cu/SiO2相比，Ag-Cu/SiO2在一定时间内能有效地抑制细菌增长，进一步验证了双金属纳米颗粒之间的协同抗菌效应。

2.4 杀菌机制分析

金属纳米颗粒的抗菌活性与细胞内活性氧(ROS)含量有关。DCFH-DA荧光探针是检测胞内ROS水平的一种途径，DCFH-DA探针进入细菌胞内，与酯酶作用后被水解生成二氯荧光黄素(DCFH)，最后不能通过细胞膜且无荧光的DCFH被ROS氧化为具有荧光的二氯荧光素(DCF)。表2示出不同二氧化硅包覆金属纳米颗粒对S.aureus和E.coli的相对荧光强度。可以看出，经过处理后S.aureus和E.coli的荧光强度有不同幅度的增强，说明细菌胞内活性氧含量不同程度的增多是因为Ag-Cu/SiO2、Ag/SiO2、Cu/SiO2的加入，其中Ag-Cu/SiO2>Ag/SiO2>Cu/SiO2。对S.aureus而言，加入Ag-Cu/SiO2后胞内活性氧的荧光强度是Ag/SiO2的1.79倍，是Cu/SiO2的2.89倍；对E.coli而言，加入Ag-Cu/SiO2后胞内活性氧的荧光强度是50% Ag/SiO2的1.09倍，是Cu/SiO2的1.77倍。研究表明，过量ROS会损伤生物大分子最终使细菌死亡[24]。结合金属纳米颗粒的抗菌活性结果发现，ROS含量与抗菌活性成正比。进一步的说明，Ag-Cu/SiO2中Ag、Cu之间产生了协同作用使ROS水平大幅增加，进而使其抗菌活性增强，因此认为Ag-Cu/SiO2使细菌胞内活性氧含量大幅增加，以致细菌死亡是银铜双金属间协同抗菌作用表现形式之一，故Ag-Cu/SiO2产生大量ROS是该双金属纳米材料的一种协同抗菌机制。

表2 不同二氧化硅包覆金属纳米颗粒对S.aureus和E.coli的相对荧光强度Tab.2 Relative fluorescence intensity of S. aureus and E.coli with different silica coated metal nanoparticles

3 结 论

本文采用气溶胶一步法成功制备了“火龙果”型二氧化硅包覆银铜双金属纳米颗粒Ag-Cu/SiO2，并将其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行抗菌性能及抗菌机制研究，得出以下主要结论。

1) Ag-Cu/SiO2是一种高负载量的强效抗菌剂，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有优良的抗菌效果，其最低抑菌浓度(MIC值)均为2 μg/mL，并且在24 h内可以充分抑制细菌生长。

2) 与单金属纳米颗粒Ag/SiO2和Cu/SiO2相比，双金属纳米颗粒Ag-Cu/SiO2的抗菌活性更强，这是因为双金属之间的协同作用引起的。

3) 通过测量加入金属纳米颗粒之后细菌胞内活性氧的含量发现，纳米颗粒抗菌剂的加入使活性氧含量不同程度的增多。与Ag/SiO2、Cu/SiO2相比，Ag-Cu/SiO2的双金属之间的协同作用使胞内活性氧水平明显增高，大量胞内活性氧会导致细菌死亡，从而使Ag-Cu/SiO2展现了更强的抗菌活性。