苍艾挥发油经豚鼠外耳道给药的安全性评价*

杨 洪，张建英，任丹妮，王进进，熊 磊，秦 琼

（1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；2.云南中医药大学第一附属医院，云南 昆明 650021）

苍艾挥发油是以熊磊教授预防上呼吸道感染的临床验方为基础，选用苍术、艾叶、丁香、藿香、豆蔻、花椒、佩兰7味中药组成[1]。组方气味清香，祛风燥湿止痒，符合“芳香化浊避秽”的用药原则，部分药物还有增强机体特异性、非特异性免疫的功能[2-3]。前期急性毒性实验确定了小鼠灌胃浓度为3.47 mL/kg，相当于儿童最大用量的2 478.57倍，呼吸刺激性实验证明苍艾挥发油对家兔呼吸系统无明显刺激作用[4]。在对肺气虚大鼠进行灌胃给药时，发现苍艾挥发油高、中剂量组CD4+/CD8+比值显著升高，能够有效调节T细胞亚群比例，从而改善肺气虚大鼠肺组织病理变化[5]。苍艾挥发油经鼻吸收后，能够快速的分布在肺组织、心脏及脑组织中，展示了经鼻给药后其良好的肺靶向及脑靶向趋势[6-7]。

前期研究发现苍艾挥发油用于空气消毒、灭菌效果优于醋熏及紫外线消毒，且对白色念珠菌有较强的抑制作用[8]，其组方中单味药所制的挥发油大都具有抗真菌作用[9-10]。在前期药效实验发现苍艾挥发油对外耳道真菌病常见感染菌如曲霉菌、白色念珠菌、青霉菌均有一定的抑制效果[11]。随着抗生素、激素的临床大量应用，外耳道真菌病发病率有上升趋势。目前外耳道真菌病治疗方法存在一定的局限性，临床效果不尽如人意，且复发率较高[12-15]。苍艾挥发油对外耳道真菌病常见菌群有一定的抑制作用，为进一步研究其外耳道给药的可行性，本实验通过豚鼠外耳道急性毒性、皮肤过敏性、外耳道皮肤刺激性进行考察，为评价该制剂临床外耳道用药安全性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 豚鼠，雌雄各半，体质量219～292 g，由昆明楚商科技有限公司提供，生产许可证号：SCXK（滇）K2018-0001。所有动物均饲养于云南中医药大学动物实验中心，饲养室温度（23±2）℃，湿度40%～70%，光照周期12 h，自由进食饮水，适应性喂养1周后进行实验。

1.2 药物与试剂 苍艾挥发油取自云南中医药大学芳香疗法实验室，苍艾挥发油的提取[16]采用水蒸气蒸馏法。按比例称取苍术、艾叶等药物，加8倍量水，浸泡4 h，提取6 h而成。聚山梨酯80（一般药用，广州赛国生物科技有限公司产品，批号：EZ4567C109）；用聚山梨酯80作为溶剂，分别将100%苍艾挥发油原液和聚山梨酯80放入研钵中进行研磨，待溶解后加入适量的纯净水，稀释成浓度分别为1%、5%、15%浓度的水溶液，每瓶各20 mL，并用等体积聚山梨酯80水溶液作为阴性对照。

1.3 实验方法

1.3.1 外耳道急性毒性实验 取健康豚鼠8只，随机分为外耳道皮肤完整组及外耳道皮肤破损组，每组各4只。实验前完成称重、右侧外耳道及鼓膜的检查。外耳道破损组使用消毒后的砂纸卷曲成小火柴棍状，作“*”样轻轻搔刮右侧外耳道皮肤，以微微出血为原则并且不伤及鼓膜，造成临床上自然的外耳道损伤，模拟人类自然挖耳导致的外耳道皮肤损伤状况；另一组右侧外耳道皮肤完整无破损。每组豚鼠做好染色标识，前期药效实验发现15%为有效浓度，故本实验选用15%浓度，通过增加给药次数，使其给药剂量远超出临床剂量，即为急性毒性实验。将15%苍艾挥发油水溶液分别滴入豚鼠的右侧外耳道内，1次滴入20 μL，上午给药2次，间隔4～5 h后再给药2次。给药次日清水清洗给药部位，连续处理7 d[17-18]。每天记录各组豚鼠的体质量，观察其饮食、皮肤、毛发、睡眠、分泌物、排泄物、外耳道及鼓膜是否有异常变化，并观察其呼吸系统、中枢神经系统和四肢活动等是否有中毒表现。若出现中毒反应，则记录反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆等，如出现动物死亡，及时观察并尸检，必要时进行病理学检查。

1.3.2 皮肤过敏性实验 选择健康豚鼠16只，按不同浓度的受试药液随机分为4组，每组4只。于实验前做好染色标识并用剪刀剪除背部面积约4 cm×4 cm的长毛，剃须刀剃净短毛，使皮肤外露，并完成称重。将豚鼠去毛区域分为大小均等两格，其中一格为皮肤破损面，用粗磨砂纸对豚鼠背部皮肤进行轻微的摩擦，使皮肤表面微微出血即可；另一格为皮肤完整面，将1%、5%、15%苍艾挥发油水剂分别滴入对应的豚鼠背部皮肤，对照组选用聚山梨酯80水溶液滴入，每次滴入0.5 mL并用棉签涂抹均匀，保证给药面积均为2.5 cm×2.5 cm，且覆盖皮肤完整面和皮肤破损面，涂抹后用无菌纱布覆盖给药区域，并用低过敏胶布固定，放置笼内。6 h后除去胶布和纱布，连续给药7 d，每天1次，末次给药24 h后洗去残留药物[19]。观察1、24、48、72 h局部皮肤的红斑、水肿等情况，按《皮肤过敏反应程度的评分标准》[20]进行评分。

1.3.3 外耳道皮肤刺激性试验 选择健康豚鼠16只，按不同浓度的受试药液随机分为4组，每组各4只，并做好染色标识，豚鼠右侧外耳道为破损模型，同上处理造成外耳道损伤模型，左侧外耳道为皮肤完整模型。豚鼠左右耳均放置相同浓度药液棉球进行对照。将1%、5%、15%的苍艾挥发油水溶液浸透棉球，第4组用聚山梨酯80水溶液棉球浸湿作为阴性对照，将浸有药液的棉球放置在豚鼠外耳道内，覆盖于外耳道内壁，并以干净的棉球填塞固定，外耳口软胶布封闭固定，6 h后除去包扎和棉球，每天给药1次，连续给药7 d[21]。每天观察贴药区外耳道内有无红斑、水肿、出血、渗液、溃烂、色素沉着、皮肤粗糙或菲薄以及鼓膜颜色，有无穿孔等反应，停药后继续观察72 h，按《皮肤刺激反应评分标准》[22]进行评分。

1.4 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较，方差齐时采用独立样本t检验，方差不齐时采用非参数检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 苍艾挥发油水溶液对豚鼠外耳道急性毒性作用涂抹药液期间及给药后7 d内，所有豚鼠外观、行为、鼓膜情况、四肢活动、进食、排泄等未见明显异常，无死亡，体质量增长正常。急性毒性2组均未见明显毒性，见图1。完整组体质量与破损组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。

表1 苍艾挥发油水溶液对外耳道给药急性毒性豚鼠体质量增长的影响（（±s，n=4，g）

表1 苍艾挥发油水溶液对外耳道给药急性毒性豚鼠体质量增长的影响（（±s，n=4，g）

组别 给药前 给药3 d 给药7 d完整组 274.80±11.68 285.30±5.83 291.45±8.35破损组 275.00±24.80 280.88±25.44 295.40±18.70

图1 豚鼠急性毒性实验

2.2 皮肤过敏性实验 苍艾挥发油水溶液及聚山梨酯80水溶液，涂抹豚鼠背部，皮肤完整组与皮肤破损组均未出现红斑、红肿等反应，过敏反应评分值均为0，致敏率为0%，评价为无致敏性，见表2。

表2 各组豚鼠皮肤过敏性评价及致敏发生率（n=4）

2.3 外耳道皮肤刺激实验 豚鼠外耳道完整组与破损组连续7 d涂抹苍艾挥发油水溶液和聚山梨酯80水溶液，均未出现明显的红斑、水肿以及鼓膜变化反应。完整组皮肤正常，皮肤破损组7 d后均正常愈合，干痂脱落，无明显刺激性，见图2。苍艾挥发油水溶液、聚山梨酯80水溶液对外耳道及鼓膜刺激反应评分，见表3。

表3 各组豚鼠皮肤刺激反应评分（n=4）

图2 豚鼠外耳道皮肤刺激性实验

3 讨论

中药挥发油在耳鼻喉科具有潜在应用前景。有研究报道，辛夷挥发油纳米脂质体滴鼻剂用于确诊的变应性鼻炎儿童，综合有效率和主要症状有效率，均高于对照组；喷嚏、鼻塞等主要症状及血液嗜酸性粒细胞计数均较对照组改善；临床效果好，疗效肯定，副作用少，得到患者的认可[23]。另有研究根据患者症状选用不同的天然植物挥发油治疗儿童慢性咽炎，疗效确切无副作用，易被患儿及家属接受[24]。本课题通过探究中药挥发油经外耳道给药的安全性，使其更好的应用于耳部治疗，增强其临床治疗效果，充分发挥中医药特色及优势。

经外耳道给药是治疗耳科疾病的主要给药方法，其给药方式一般分为水剂、乳膏剂、喷雾剂给药[25]。有报道表明水剂滴耳液使用方便，患者依从性较高，药物分布相对均匀，疗效肯定；而膏剂因患者外耳道弯曲或狭窄等因素导致药物涂抹不到位，容易造成外耳道损伤，患者需经常至门诊给药，依从性较差，从而影响治疗效果[26]。目前外耳道真菌病主要治疗方法为耳内镜清理之后运用抗真菌药物治疗，但清理之后的药物治疗选择及给药方法未有明确指导[12]。抗真菌水剂在临床中使用更方便，患者接受程度高，依从性好，药物分布均匀可触及深处的病变范围，但应用于耳部的抗真菌滴耳液暂无上市的外用水剂[27]。因此，研发一种抗真菌能力强的水剂滴耳液具有重要的临床意义。

苍艾挥发油是由苍术、艾叶等组成的经验方提取而来的复方精油[16]，几乎不溶于水，通过加入助溶剂，可做成水剂。中药挥发油不仅具有促透皮吸收作用[28]，且安全性好，对皮肤无刺激和毒性较低[29]，部分中药挥发油因具有较强的抗菌、抗病毒活性而广泛用于外科治疗[30]。本实验选用聚山梨酯80作为助溶剂，其在经口途径、肌肉注射或静脉注射药物制剂中大量应用，具有较宽的安全窗[31-32]。在实验过程中，发现苍艾挥发油水溶剂安全无毒性能够很快自然挥发，不会潴留在耳道内，而引起不适。

为了进一步推广苍艾挥发油水剂在临床中的应用，保证其用药安全性，进行外耳道急性毒性实验、皮肤过敏性实验、外耳道皮肤刺激性实验。结果显示，苍艾挥发油水溶剂经外耳道给药无毒性，对豚鼠一般情况无明显影响。给药及恢复期间，所有豚鼠的行为、饮水进食、排泄物、毛发基本正常。苍艾制剂对豚鼠听力无影响，对鼓膜、外耳道无刺激性、无过敏性等不良反应，所有豚鼠均无死亡发生，体质量增长正常。以上结果表明苍艾挥发油是一种安全性较高的外用中成药，可应用于临床耳部局部给药。