小檗碱在牙源性干细胞和口腔疾病的研究进展

叶明君，沈山

(暨南大学口腔医学院，广东 广州 510620)

0 引言

小檗碱是一种从黄连、黄柏等中草药中提取分离的小分子异喹啉生物碱[1]，具有多种药理作用，如抗菌、抗炎、抗癌和抗氧化作用[2,3]。它对消化系统、代谢、心血管系统、神经系统等疾病具有广泛的药理活性[4]，是治疗肌肉骨骼疾病的潜在药物[5]。

目前从牙体组织已经分离出多种类型的牙源性干细胞，包括牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、牙周膜干细胞、根尖牙乳头干细胞、牙囊干细胞[6]。相比较骨髓间充质干细胞(MSCs)，牙源性干细胞具有提取简单、侵入性小、不存在与使用有关的道德考虑等优点[6]，近些年被广泛研究。参与调控牙源性干细胞分化涉及多个信号通路，目前已知的信号通路包括丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、骨形成蛋白(BMP)、Notch、Wnt等[7]。本文描述了小檗碱对牙髓干细胞、牙周膜干细胞、根尖牙乳头干细胞三种牙源性干细胞的增殖分化作用和机制，以及对口腔肿瘤、种植体周围炎、牙周炎、口腔白色念珠菌感染的药理作用和机制作简要综述，以期为小檗碱在口腔医学领域研究提供一定的思路和参考资料。

1 小檗碱对牙源性干细胞的作用及机制

1.1 牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, DPSCs)

DPSCs是从人类的下颌第三磨牙的牙髓组织中提取分离出的，这些细胞可以分化为成骨细胞、成牙本质细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经元[8,9]。

1.1.1 促牙本质生成

之前研究已经证明了DPSCs具有分化为成牙本质细胞的能力[10]。但是，当牙髓受到严重破坏，内源性DPSCs的数量不足以修复主要的牙齿损伤[11]。根据Wu等[12]人的体外细胞研究，小檗碱对DPSCs向成牙本质细胞分化具有积极作用，他们研究发现小檗碱通过经典的Wnt/β-catenin途径加速了DPSCs的成牙本质细胞分化并增加了成牙本质细胞分化标记蛋白的表达，从而促进DPSCs的成牙本质细胞分化。而毕磊等[13]体外研究验证了小檗碱可能通过激活MAPK/ERK信号通路促进DPSCs成牙本质向分化。

1.1.2 促进成骨

研究显示，小檗碱在PKA、p38 MAPK、Wnt/β-catenin和AMPK信号传导中起激活剂作用，以增加Runx2和osterix的表达，从而导致成骨[14]。Runx2编码一种核蛋白，它是成骨细胞分化的关键调节剂，它可以刺激hDPSCs的钙积累和碱性磷酸酶活性[15]，特别是在成骨分化的早期，MAPK信号通路在Runx2的激活中起关键作用[16]。

Xin等[17]体外研究发现小檗碱能够促进 DPSCs细胞增殖和成骨，随后他们进一步分析其机制，小檗碱可以与hDPSCs表面的表皮生长因子受体(EGFR)相互作用并激活MAPK途径来促进hDPSCs的成骨分化。Ma等[18]首次通过静电纺丝制备了含有不同浓度小檗碱的小檗碱/聚己内酯/胶原蛋白支架，研究发现该支架在体外促进DPSCs成骨分化，在大鼠体内可加速骨缺损修复过程。

1.1.3 抑制成脂分化

关于DPSCs的脂肪分化研究，在一些疾病研究，如糖尿病、肥胖相关的疾病等，可能是非常有益的[10]。Xing等[19]研究发现DPSCs在完全间充质成脂培养基中培养获得脂肪细胞。之前研究表明小檗碱抑制骨髓间充质细胞成脂相关标志基因的表达，有效抑制3T3-L1细胞成脂[20]，Xin等人[17]体外研究发现DPSCs经较高剂量的小檗碱处理后，细胞中的脂滴明显下降，这说明小檗碱抑制DPSCs成脂分化，这也从另一方面表示DPSCs的多能性与MSCs非常相似。

1.2 牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell，PDLSCs)

它是从拔除的人第三恒磨牙牙周组织中分离培养出的，在牙周膜中具有多向分化潜能，能够增殖分化为成骨细胞、成纤维细胞以及成牙骨质细胞[21]。

1.2.1 促进成骨

PDLSCs通过不断增值和定向分化促进牙周组织的修复再生，在维持牙周稳态具有重要作用。Liu等[22]开发人牙周膜细胞膜色谱(PDLSC/CMC)与高效液相色谱-质谱(LC/MS)联用的小檗碱成骨活性成分分析方法，他们发现小檗碱能促进PDLSCs生长，增加碱性磷酸酶的分泌，促进矿化结节的形成，是一种潜在的成骨成分。他们后续研究发现在适当的浓度(0.1mg/L)下，小檗碱可以在细胞生长和成骨中发挥积极作用[23]。关于机制，他们研究认为EGFR可能是小檗碱与PDLSCs膜之间的靶位点，小檗碱可以与牙周膜干细胞细胞膜上的EGFR结合，激活细胞内ERK信号通路，引起核相关基因FOS上调，从而加速了PDLSCs的成骨作用[23]。

1.2.2 对糖尿病相关牙周炎的作用

关于糖尿病引起牙周炎的病理机制，学者目前提出两种假说，分别是骨代谢异常学说和菌群失调学说[24]。刘灵鲁等[24]通过对糖尿病大鼠模型的研究，证实小檗碱具有良好的降糖和促成骨作用以及调节牙周菌群的功能。相关文献报道，小檗碱可以抑制牙周炎关系密切的细菌，如牙龈卟啉单胞菌，伴放线放线杆菌和中间普氏杆菌[25,26]，先前研究显示小檗碱可以逆转牙龈卟啉单胞菌感染诱导的骨髓间充质干细胞中成骨相关基因表达的下调，恢复成骨分化[27]。Zhang等[28]研究发现小檗碱在糖尿病患者的PDLSCs诱导的牙周再生中具有作用，它是通过抑制经典的Wnt/β-catenin途径，从而减弱了糖基化终末产物(AGEs)对PDLSCs成骨分化能力的抑制。

1.3 根尖牙乳头干细胞(stem cell from apical papilla，SCAP)

受感染的未成熟恒牙中的干细胞，会从受伤的牙齿组织释放促炎细胞因子，如TNF-α和IL-1β，它们在正常情况下不表达或极低水平表达[29]。TNF-α在炎性阶段的根尖周骨缺损中起重要作用，并抑制SCAP成骨细胞分化[30]。此外，细菌生物膜及其副产物的水平能够改变SCAP的成骨分化[31]，Cui等[32]将小檗碱应用于具有根尖周炎的大鼠年轻恒牙根管中，他们观察到新组织沿根部明显形成。随后，他们进一步研究发现小檗碱通过激活SCAP中的经典Wnt/β-catenin信号传导途径，从而增强了患有根尖周炎的大鼠年轻恒牙的根修复。

2 小檗碱在与口腔相关疾病中的作用及其机制

2.1 口腔肿瘤

小檗碱的抗肿瘤机制可以概括为五个方面：增殖(包括凋亡、自噬、细胞周期停滞等)、细胞内氧化应激、炎症、血管生成和迁移[33]。根据目前的文献报道，小檗碱对口腔肿瘤的作用机制包括促进肿瘤细胞凋亡和细胞周期停滞、阻止肿瘤细胞迁移和侵袭。

2.1.1 促进肿瘤细胞凋亡和细胞周期停滞

Lin等[34]体外研究发现小檗碱诱导了口咽癌HSC-3细胞周期停滞和凋亡，它诱导的细胞凋亡与细胞色素释放和ccaspase-3激活相关。Ho等[35]体外研究表明小檗碱增加人舌癌SCC-4细胞内ROS的产生和胞内Ca2+水平，从而刺激促凋亡Bax蛋白的表达，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，而且，与DNA损伤有关的核酸内切酶G的基因表达，最终导致肿瘤细胞凋亡。他们还在舌癌移植小鼠模体内研究发现，小檗碱每4天一次，每次10mg/kg，可有效减少舌SCC-4肿瘤的生长[36]，这是首次动物体内检验小檗碱作为舌癌预防剂的作用。其中，小鼠模型体内研究与他们之前体外究中的小檗碱浓度(30μmol/L)相似。此外，小檗碱还可抑制人口腔鳞癌细胞系HN-4的活性，并诱导其凋亡和线粒体膜电位的减少[37]。

2.1.2 阻止肿瘤细胞迁移和侵袭

基质金属蛋白酶(MMP)在癌症转移和血管生成中起着重要作用。Ho等[38]体外研究发现小檗碱可以通过抑制MAPK和NF-κB信号通路，从而抑制MMP-2和MMP-9的表达，以阻止人SCC-4舌癌细胞的迁移和侵袭。

2.2 对种植体骨结合的作用及机制

Lu等[39]两位学者发现胰岛素和小檗碱联用可有效降低Ⅱ型糖尿病大鼠血糖，并促进种植体的骨结合[40]，但他们并没有进一步解释其机理。Shao等[41]体外实验表明，小檗碱通过上调ROS介导的IRS-1信号传导，从而减轻了高葡萄糖浓度下，骨髓间充质干细胞成骨作用受到抑制。Wang等[42]体外实验发现较高浓度(＞30μmol/mL)的小檗碱可在24h内有效防止钛表面上的表皮葡萄球菌生物膜形成。另外，最近一项体外研究结果表明，在脂多糖(LPS)刺激的炎症环境中，小檗碱具有明显的促成骨作用和抗脂肪形成作用，以上表明小檗碱在与细菌感染相关的种植体周围炎药物治疗中具有潜在的作用[43]。

2.3 牙周炎

2.3.1 抗炎、预防骨丢失、成骨作用

p38MAPK /NF-κB途径在促炎细胞因子的产生中起关键性调节作用[44]，小檗碱可以通过抑制MAPK途径的激活来减少炎性反应[45]，其中G蛋白偶联受体30(GPR30)为p38MAPK/NF-κB通路的关键调节器[46]。关于其成骨机制的研究，小檗碱通过p38MAPK信号通路或经典的Wnt/β-catenin信号通路激活Runx2转录活性，从而促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[20]。

Gu等[47]基于对结扎诱导的牙周炎大鼠模型的研究，提出小檗碱通过增加GRP30，抑制P38MAPK/NF-κB通路来预防牙周炎中牙槽骨的丢失和炎症。Tu等[48]也是使用结扎方法建立牙周炎大鼠模型，发现小檗碱可通过下调基质金属蛋白酶的活性来减缓牙周组织降解。有研究显示，肠道菌群与骨骼代谢之间存在密切关系[49]。Jia等[50]对大鼠去卵巢建立了实验性牙周炎模型，他们发现小檗碱可通过调节肠道菌群来预防卵巢切除大鼠雌激素缺乏引起的牙槽骨丢失。这是由于小檗碱通过丰富丁酸产生菌，提高肠道丁酸浓度，恢复肠道屏障，防止血清和牙槽骨中IL-17A相关的免疫异常，从而改善去卵巢牙周炎大鼠的牙槽骨丢失。王希等[51]研究小檗碱、奥硝唑及联合用药对常见牙周致病菌的体外抗菌活性，发现二者联合用药对牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌具有协同抑菌作用，对抑制具核梭杆菌表现为相加作用，对黏性放线菌具有互补作用。因此，他们认为二者联合用药可用于治疗牙周炎混合感染。

然而，牙周炎的发展涉及与细菌和免疫调节有关的复杂机制，在大鼠中进行的实验性牙周炎仍然面临一定的局限性，关于小檗碱对牙周炎的药理作用还需要进一步研究其机制。

2.4 口腔念珠菌感染

近些年来，临床出现与生物膜形成相关的咪唑类耐药性真菌。众多学者建立小檗碱与咪唑类的协同组合以增强咪唑类药物的药效作用，尤其是用作抗念珠菌病的一线药物—氟康唑。

小檗碱对念珠菌生物膜具有与浓度相关的抑制作用，随着念珠菌生物膜的成熟而增强，小檗碱在48h时对念珠菌生物膜的抑制作用最高[52]。细胞内小檗碱不足会导致小檗碱具有中等的抗菌活性，而氟康唑能介导真菌细胞质膜破坏，增加了细胞内小檗碱的浓度[53]。Shao等[54]体外研究发现小檗碱通过抑制外排转运蛋白，降低了细胞外罗丹明123(Rh123)。Li等[55]发现小檗碱积累在白色念珠菌细胞核中，与DNA结合，从而导致细胞周期停滞和DNA损伤。Xu等[56]体外研究发现氟康唑和小檗碱处理影响能量代谢中蛋白质的表达，通过增加内源性活性氧的产生来诱导白色念珠菌的细胞损伤。他们后续又研究表明了氟康唑可以通过抑制麦角固醇的合成来增强氟康唑耐药的白色念珠菌对小檗碱的敏感性[57]。此外，这种组合还可以下调外排泵基因CDR1和CDR2的过表达[58]。

3 总结与展望

小檗碱源自药用植物的天然化合物，不但具有多种药理作用，而且毒性较低、副作用小[59]。本文归纳了小檗碱在口腔医学领域的研究成果，在牙源性干细胞研究中，发现小檗碱能够通过经典的Wnt/β-catenin途径、MAPK/ERK信号通路促进DPSCs的多向增值分化，如成牙本质性、成骨性等。通过经典的Wnt/β-catenin途径促进hPDLSC、SCAP成骨分化。另外，小檗碱还抑制DPSCs成脂分化。在与口腔其他相关疾病的研究中，发现小檗碱通过促进肿瘤细胞凋亡和细胞周期停滞、阻止肿瘤细胞迁移和侵袭等机制，发挥抗癌活性。因小檗碱具有抗菌斑生物膜、促成骨作用和抗脂肪形成作用，对钛种植体骨结合也有一定作用，对预防种植体周围炎有潜在价值。通过抑制P38MAPK/NF-κB通路、下调基质金属蛋白酶的活性、调节肠道菌群、抑制常见的牙周致病菌等机制，来预防牙周炎中牙槽骨炎症和骨量丢失。因其固有的降血糖作用以及抑制经典的Wnt/β-catenin途径减弱了AGEs对hPDLSCs的成骨分化能力抑制，从而对糖尿病相关的牙周炎治疗有潜在的治疗价值。此外，小檗碱通过增加活性氧、细胞内小檗碱积累、麦角固醇减少和外排抑制来增强氟康唑耐药白色念珠菌的氟康唑效应。最后，由于自身的抑菌效应，2mg/mL的小檗碱可与1%洗必泰联用作为根管冲洗液[25]，有效地减少了粪肠球菌的感染[60]。

但是，目前小檗碱在口腔领域的研究多是体外细胞研究，没有研究揭示与成牙分化相关的信号通路是存在相互作用、共同影响，还是牙源性干细胞成牙分化的信号通路具有特异性或共性。因此后续研究还需要继续深入以探讨其作用机制，发挥其在组织工程和再生医学领域的优势[61]。值得一提的是，还没有文献报道小檗碱对脱落乳牙牙髓干细胞，牙囊干细胞的增值分化影响。在小檗碱对口腔相关疾病的作用中，小檗碱在口腔肿瘤的作用机制研究多是10多年前的体外和一些动物体内研究，近些年小檗碱对口腔肿瘤的药理作用机制研究较少，所以揭露的作用机制目前只有两种。如今临床应用的化疗药物存在严重的副作用，如骨髓抑制和贫血[62]。因此，如果期待小檗碱作为替代药物或者联合药物来克服这些缺点，后续还需要深入地研究其机制及其安全性。另外，小檗碱在具有挑战性的微生物感染治疗中存在优势，但其体内抗菌活性不足以取代临床上现有的抗菌剂[43]，将小檗碱作为先导化合物来修饰其结构，以期增强其抗菌活性或者其他药理活性[63]。